細(xì)胞自噬對(duì)造血干細(xì)胞的影響研究進(jìn)展

張 迪，曾夢(mèng)穎,閆曉霞，嚴(yán)玉霖，高 洪

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650201)

老化是許多疾病發(fā)生的最大危險(xiǎn)因素。生理老化是一個(gè)復(fù)雜的多因素過程，受遺傳和環(huán)境因素的調(diào)節(jié)。雖然整個(gè)身體中的組織以不同的方式受到影響，但出現(xiàn)老化的一個(gè)共同特征就是組織功能水平的降低，這一現(xiàn)象通常與干細(xì)胞活性的降低有關(guān)[1]。血液系統(tǒng)在維持機(jī)體健康的各個(gè)方面都發(fā)揮著重要作用，并且維持血液生成依賴于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSC)自我更新并分化為成熟血細(xì)胞所有譜系的的能力。

研究表明,造血干細(xì)胞自噬能力的損失會(huì)導(dǎo)致線粒體的積累使細(xì)胞處于一種活化的代謝狀態(tài)，其主要通過調(diào)控表觀遺傳驅(qū)動(dòng)來加速骨髓分化，影響造血干細(xì)胞自我更新活動(dòng)并損害其再生潛力。成年小鼠中的大部分造血干細(xì)胞的代謝和功能特征都會(huì)發(fā)生改變。然而，大約三分之一的成年造血干細(xì)胞具有類似于健康的年輕造血干細(xì)胞的強(qiáng)大的長(zhǎng)期再生潛力，表現(xiàn)出高自噬水平和低代謝狀態(tài)。相關(guān)研究結(jié)果表明,自噬通過清除活躍、健康的線粒體抑制造血干細(xì)胞代謝，保持穩(wěn)態(tài)和干性，隨著年齡增長(zhǎng)，維持老的造血干細(xì)胞的再生能力變得越來越重要[2]。論文就近些年來自噬在造血干細(xì)胞的特性維持方面的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，目的是揭示自噬對(duì)造血干細(xì)胞的重要性，提高對(duì)于自噬在干細(xì)胞生物學(xué)功能中作用的認(rèn)識(shí)。

1 細(xì)胞自噬及其分子機(jī)制

自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)的一種“自食(self-eating)”的現(xiàn)象，是指膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等形成自噬體(autophagosome)，最后與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autopholysome)，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器的更新[3]。當(dāng)機(jī)體缺乏營(yíng)養(yǎng)或產(chǎn)生其他應(yīng)激原時(shí)，細(xì)胞自噬通過分解衰老的細(xì)胞器和變性的生物大分子為細(xì)胞的生存提供物質(zhì)和能量支持。目前根據(jù)發(fā)生過程將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。

巨自噬(macroautophagy)即我們說的自噬(autophagy)。Macroautophagy是進(jìn)化上保守的細(xì)胞過程，特征是會(huì)形成自噬體雙膜囊泡。通過該過程細(xì)胞將其細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的一部分隔離成雙膜囊泡，稱為自噬體，隨后與溶酶體融合以降解封閉內(nèi)容物。自噬體形成由一系列蛋白質(zhì)復(fù)合物控制，包括用于誘導(dǎo)自噬的ULK1-ATG13-RB1CC1/FIP200C12或f44/ATG101復(fù)合物，引發(fā)自噬體形成的Ⅲ類磷脂酰肌醇(PtdIns)3-激酶復(fù)合物(包括BECN1、ATG14/ATG14L/BAGOR、PIK3R4/VPS15、PIK3C3/VPS34和AMBRA1)，以及自噬體雙膜的延伸和閉合所需的ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物和MAP1LC3A/LC3(ATG8同源物)-磷脂酰乙醇胺(PE)復(fù)合物(兩種泛素樣綴合系統(tǒng))[4]。除了這些核心成分外，還有許多其他以酵母為特征的自噬相關(guān)基因(autophagy associated gene,ATG)及其哺乳動(dòng)物直系同源物也是自噬需要的。自噬相關(guān)基因參與調(diào)節(jié)自噬起始和延伸等過程[5]。

自噬傳遞信號(hào)通路包括起抑制作用的Class Ⅰ PI3K pathway(PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇)、mTOR pathway(mammalian target of rapamycin)和激活自噬的Class Ⅲ PI3K通路，它在結(jié)構(gòu)上類似于Class Ⅰ PI3K，但作用相反[6]。

細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對(duì)自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)。由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需采用透射電鏡技術(shù)。吞噬泡(phagophore)的特征為新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。自噬體(autophagic vacuole，AV1)的特征為雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2)的特征為單層膜，胞漿成分已降解。

由于電鏡檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)(monitoring)自噬形成，人們利用微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtu-buleassociated protein light chain 3，MAP-LC3，簡(jiǎn)稱LC3)在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成。無自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，1個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于1個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)自噬活性的高低。自噬形成時(shí)，胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，可以利用Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的變化來評(píng)價(jià)自噬水平的高低。另外，LC3抗體對(duì)LC3-Ⅱ有更高的親和力，會(huì)造成假陽性。因此，GFP-LC3融合蛋白和Western blot需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響[7]。

2 造血干細(xì)胞的功能特性

1961年Till J E、McCulloch E A用小鼠體內(nèi)脾結(jié)節(jié)方法第一次證實(shí)了造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的存在。20世紀(jì)80年代后，Weissman等多個(gè)實(shí)驗(yàn)室相繼通過細(xì)胞表面標(biāo)記分離出高度純化的不同階段的造血干/祖細(xì)胞。在小鼠造血干細(xì)胞的研究中，造血干細(xì)胞的分離是通過細(xì)胞表面標(biāo)記Lineage Sca-1c-kit或者細(xì)胞代謝方面的特性(側(cè)群細(xì)胞)借助于流式細(xì)胞儀實(shí)現(xiàn)的。20世紀(jì)90年代通過引入CD34這個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記區(qū)分小鼠中長(zhǎng)期造血干細(xì)胞和短期造血干細(xì)胞。進(jìn)入21世紀(jì)后，基于SLAM家族分子(CD41，CD48和CD150)進(jìn)一步富集造血干細(xì)胞，SLAM分子在造血干細(xì)胞的表達(dá)比較穩(wěn)定，并且能夠廣泛的應(yīng)用于各品系的實(shí)驗(yàn)小鼠。人HSC表面標(biāo)記研究也同步發(fā)展，目前使用比較廣泛的人的造血干細(xì)胞表面標(biāo)記為L(zhǎng)ineageCD34CD38[8]，其中造血干細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)的表面標(biāo)志分子為CD34+。

造血干細(xì)胞又稱多能造血干細(xì)胞，是存在于造血組織中的一群原始造血細(xì)胞，也可以說它是一切血細(xì)胞(其中大多數(shù)是免疫細(xì)胞)的原始細(xì)胞。它是發(fā)現(xiàn)最早、研究較多、在臨床中廣泛應(yīng)用的一類重要的成體組織干細(xì)胞，具有自我更新、多向分化、靜息維持、凋亡控制和運(yùn)動(dòng)遷移這五大特性。造血干細(xì)胞定向分化、增殖為不同的血細(xì)胞系，并進(jìn)一步生成血細(xì)胞。人類造血干細(xì)胞首先出現(xiàn)于胚齡第2周～第3周的卵黃囊，在胚胎早期(第2月～第3月)遷至肝、脾，第5個(gè)月又從肝、脾遷至骨髓。在胚胎末期一直到出生后，骨髓成為造血干細(xì)胞的主要來源。在胚胎和迅速再生的骨髓中，造血干細(xì)胞多處于增殖周期之中；而在正常骨髓中，則多數(shù)處于靜止期(G0期)，當(dāng)機(jī)體需要時(shí)，其中一部分分化成熟，另一部分進(jìn)行分化增殖，以維持造血干細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)機(jī)體失血或者需要補(bǔ)充正常生理代謝過程中消耗的血液細(xì)胞時(shí)，HSC才會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞周期。HSC靜止、自我更新和分化之間取得了很好的平衡，當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一些嚴(yán)重的后果，如造成某些譜系的偏差分化，從而消耗或過度表達(dá)(如貧血、淋巴細(xì)胞減少、骨髓增生)或形成造血惡性腫瘤(如白血病)。血液系統(tǒng)中的成熟細(xì)胞壽命極短，因此在動(dòng)物的一生中，造血干細(xì)胞需要根據(jù)機(jī)體的生理需求適時(shí)的補(bǔ)充血液系統(tǒng)各個(gè)成熟細(xì)胞組分。同時(shí)在損傷、炎癥等應(yīng)激狀態(tài)下，造血干細(xì)胞也扮演著調(diào)節(jié)和維持體內(nèi)血液系統(tǒng)各個(gè)細(xì)胞組分的生理平衡的角色。

因?yàn)樵煅杉?xì)胞有分化為其他細(xì)胞的能力，因此造血干細(xì)胞在治療疾病方面發(fā)揮著巨大的作用，常見的是造血干細(xì)胞移植。造血干細(xì)胞移植是經(jīng)大劑量放療、化療或其他免疫抑制劑進(jìn)行預(yù)處理，清除移植受體體內(nèi)的病理細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞、異常克隆細(xì)胞、病態(tài)造血細(xì)胞)或阻斷發(fā)病機(jī)制，然后把異體或自體的造血干細(xì)胞移植到受者體內(nèi)，以重建受者的正常造血及免疫功能，達(dá)到治療疾病目的的治療手段。目前的造血干細(xì)胞移植分為骨髓移植、外周造血干細(xì)胞移植、胎肝造血細(xì)胞移植和臍血造血干細(xì)胞移植等。骨髓移植主要用來治療急慢性白血病、嚴(yán)重的再生不良性貧血、地中海性貧血、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤[9]等，現(xiàn)在還用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌和卵巢癌等的嘗試。外周造血干細(xì)胞移植多用在多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤和乳腺癌等實(shí)體瘤的治療[10]。臍血造血干細(xì)胞可以用來治療多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病。另外，已有研究發(fā)現(xiàn)自體造血干細(xì)胞移植對(duì)于治療1型糖尿病有一定的療效。

3 細(xì)胞自噬與造血干細(xì)胞的關(guān)系

維持細(xì)胞健康和預(yù)防干細(xì)胞衰老對(duì)造血健康至關(guān)重要，自噬在降解受損分子和細(xì)胞器中的作用對(duì)于保持細(xì)胞年輕化很重要。因此，自噬與老化有著密不可分的聯(lián)系：①自噬水平通常隨多種細(xì)胞類型(包括造血細(xì)胞)的年齡增長(zhǎng)而降低；②ATG基因突變功能的喪失將縮短酵母的壽命[11]；③熱量限制和雷帕霉素的使用可以增加線蟲和大鼠的壽命；④小鼠自噬基因的組織特異性喪失將導(dǎo)致年齡相關(guān)疾病的發(fā)生，如神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和癌癥[12]。來自老年小鼠的HSC顯示出每個(gè)細(xì)胞的再生活性降低、自我更新和歸巢能力減弱，骨髓偏向分化和應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡水平的增加。以上這些現(xiàn)象在ATG7或RB1CC1/FIP200基因缺陷的小鼠HSC細(xì)胞中都可以觀察到[13-14]。FIP200(200 ku黏著斑激酶家族相互作用蛋白)被證明是不僅對(duì)于自噬的誘導(dǎo)，而且對(duì)體內(nèi)HSC的維持和功能也是至關(guān)重要的[15]。選擇性敲除小鼠造血系統(tǒng)Atg7基因，顯示LSK(譜系陰性、Sca-1陽性、c-kit陽性)細(xì)胞累積異常線粒體，ROS水平升高，并顯示過度的DNA損傷，導(dǎo)致HSC的喪失，即小鼠的正常造血功能喪失，出現(xiàn)嚴(yán)重的髓性增生，并于數(shù)周內(nèi)死亡[16-17]。

HSC進(jìn)入靜息通常與代謝變化相關(guān)。雖然增殖細(xì)胞將其大部分代謝能力用于生物合成，以便產(chǎn)生形成新細(xì)胞所需的材料，但靜息狀態(tài)的細(xì)胞可以緩解大量的代謝需求。HSC在非分裂期間下調(diào)蛋白質(zhì)合成并激活維持它們的途徑，除Cyclodindependency激酶抑制劑外，通過PtdIns3K-mTOR途徑調(diào)節(jié)靜止期[18]。實(shí)際上，mTOR活性增加對(duì)HSC有不利影響，包括HSC的過度增殖會(huì)導(dǎo)致白血病，其次是干細(xì)胞衰竭和造血譜系不能再生。有數(shù)據(jù)表明HSCs可以通過抑制mTOR信號(hào)恢復(fù)老年小鼠的自我更新和造血活力，并能夠通過接種流感疫苗來恢復(fù)[19]?？傮w而言，這些結(jié)果表明，自噬缺失型HSC和具有缺陷型自我更新活性和骨髓偏向分化潛能的oHSC之間存在明顯的相似性，并且證明自噬對(duì)處于老化過程和再生應(yīng)激條件下(如移植)的HSC功能至關(guān)重要。

Gata-1是調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞紅系分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。近期發(fā)現(xiàn)，Gata-1能夠激活細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3b、ATG、MAP1-LC3A、GABARAP、GABARAPL1的表達(dá)。隨著造血干細(xì)胞紅系分化成熟，Gata-1表達(dá)增加，細(xì)胞自噬相關(guān)基因表達(dá)增加，細(xì)胞自噬功能增強(qiáng)，通過細(xì)胞自噬清除細(xì)胞器，最終形成無細(xì)胞器的成熟紅細(xì)胞。Wnt信號(hào)通路在維持造血干細(xì)胞自我更新能力方面起重要作用。mTOR通過抑制自噬體的形成抑制細(xì)胞自噬。mTOR是Wnt信號(hào)通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，Wnt信號(hào)通路通過激活mTOR抑制細(xì)胞自噬[20]。

Notch信號(hào)通路對(duì)造血干細(xì)胞命運(yùn)決定及其產(chǎn)生發(fā)揮著細(xì)胞自主性調(diào)控作用。在造血干細(xì)胞分化期間，ROS逐漸增加。抑制ROS產(chǎn)生會(huì)減少造血干細(xì)胞的分化[21]。在野生型小鼠的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(progenitor cells，HSPC)中，抑制ROS產(chǎn)生，自噬活性下調(diào)，但細(xì)胞內(nèi)Notch及其下游效應(yīng)上調(diào)。相比之下，在自噬完全缺陷小鼠的HSPC中，ROS抑制不改變骨髓分化，造血干細(xì)胞分化為多譜系不再響應(yīng)于ROS抑制。在代謝過程中產(chǎn)生的線粒體ROS會(huì)觸發(fā)自噬下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Notch通路，從而促進(jìn)造血干細(xì)胞的分化。因此，自噬可以通過直接靶向Notch來調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的分化維持造血[22-23]。

事實(shí)上，現(xiàn)有資料表明干細(xì)胞的獨(dú)特性質(zhì)(自我更新、多能性、分化和靜止)取決于自噬過程的活化[24]。首先，自我更新和分化的過程需要嚴(yán)格控制細(xì)胞重塑，其涉及蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和細(xì)胞器的溶酶體降解。其次，受損大分子物質(zhì)和細(xì)胞器的消除及更替是保持長(zhǎng)壽命干細(xì)胞處于長(zhǎng)時(shí)間靜止期時(shí)的多能性所必需的。最后，基底自噬是一種穩(wěn)態(tài)過程，其調(diào)節(jié)質(zhì)量控制、清除細(xì)胞內(nèi)變化和受損傷的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，以及通過降解結(jié)構(gòu)成分進(jìn)行細(xì)胞重塑?，F(xiàn)在有越來越多的證據(jù)表明自噬在胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)、幾種組織干細(xì)胞，特別是造血干細(xì)胞(HSCs)以及許多癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)的調(diào)節(jié)中起主要作用。自噬除了作為維持干細(xì)胞干性和自我更新的重要機(jī)制之外，還參與了各種干細(xì)胞及其后代的分化調(diào)節(jié)過程。

4 小結(jié)與展望

越來越多的研究數(shù)據(jù)表明,自噬與造血干細(xì)胞的特性有密切關(guān)系。靜止?fàn)顟B(tài)下HSC中的細(xì)胞受損成分只能通過細(xì)胞自噬來清除并繼續(xù)維持靜息狀態(tài)。生理狀態(tài)下，造血干細(xì)胞內(nèi)的自噬對(duì)于維持正常的造血至關(guān)重要，但是細(xì)胞自噬對(duì)于造血影響的另一面也同樣不可忽視，某些病理?xiàng)l件下，過度激活的細(xì)胞自噬也會(huì)導(dǎo)致HSC的耗竭。因此研究造血干細(xì)胞與自噬之間的相互關(guān)系，可以為維持造血干細(xì)胞的干性，增強(qiáng)其分化能力提供一個(gè)研究方向。

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