干酪乳桿菌的免疫及其作為載體的應(yīng)用研究進(jìn)展

劉歡歡，李樹東，王珊珊，高國強，余麗蕓，侯喜林*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，革蘭陽性菌，在動物和人類腸道中廣泛存在[1]，與嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌共稱為益生菌界的“健康三益菌”，我國衛(wèi)生和計劃生育委員會于2001年將其認(rèn)定為保健益生菌菌種[2]。

干酪乳桿菌對誘發(fā)黏膜和全身免疫具有類似佐劑的作用，可提高耐受乳糖的能力；減少胃腸道病原體；減少結(jié)腸、直腸癌的發(fā)生；降低感冒發(fā)生頻率及炎癥相關(guān)疾病如潰瘍性結(jié)腸炎癥狀等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，改善宿主健康狀況可以通過改變腸道微生物群來實現(xiàn)[4]，以干酪乳桿菌為例發(fā)現(xiàn)，服用干酪乳桿菌作為微生態(tài)制劑可改變腸道中的微生物群并影響宿主免疫應(yīng)答[5]。另外，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，以益生菌作為抗原遞呈載體進(jìn)行黏膜免疫疫苗的研究，逐漸成為近年來對該領(lǐng)域研究的前沿和熱點[6]。本文將對干酪乳桿菌刺激機體產(chǎn)生的特異性和非特異性免疫及其作為抗原遞呈載體的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 干酪乳桿菌的耐受能力

干酪乳桿菌在體內(nèi)發(fā)揮免疫功能，但是機體過酸過堿的環(huán)境可能會影響其活性從而影響干酪乳桿菌的功效。因此，能否順利通過胃腸環(huán)境并成功定植于腸道黏膜以實現(xiàn)對機體的免疫功能，成為干酪乳桿菌應(yīng)用于實踐的重要依托。徐義剛等[7]對此進(jìn)行了試驗驗證，分別在體外進(jìn)行了人工胃液耐受試驗、膽汁耐受試驗和耐鹽試驗，證明重組干酪乳桿菌在人工胃液消化3 h后活菌數(shù)可達(dá)108/mL左右；在人工腸液存在明顯的生長趨勢；在鹽濃度高達(dá)3 mg/mL的膽汁可緩慢生長，對高鹽環(huán)境具有較強耐受能力，說明干酪乳桿菌可耐受機體強酸強堿環(huán)境且具備良好的存活能力。

2 干酪乳桿菌誘發(fā)的機體免疫

干酪乳桿菌的免疫途徑如下：一種是以刺激單核吞噬細(xì)胞、活性氧、溶酶體和單核因子等分泌為主的非特異性免疫；另一種則為誘發(fā)機體增加黏膜表面和血清中IgA、IgM、IgG水平，激活宿主免疫細(xì)胞，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子如白介素-1( interleukin-1,IL-1)、白介素-6( interleukin-6,IL-6)及白介素-12( interleukin-12,IL-12)等為主的特異性免疫[8]。

2.1 非特異性免疫

抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)作為先天性免疫系統(tǒng)中腸道黏膜防御的重要組成部分，在塑造腸道微生物群的組成中具有重要作用[9]。Aktas B等[10]分別對7種干酪乳桿菌進(jìn)行了試驗測定，結(jié)果表明干酪乳桿菌菌株在改善腸道微生物組成的同時與AMP調(diào)節(jié)和模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)調(diào)節(jié)之間存在一定關(guān)系。Jr B M等[11]發(fā)現(xiàn)，服用干酪乳桿菌可降低干擾素及炎性因子的產(chǎn)生，刺激白介素-10(interleukin-10,IL-10)的表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，IL-10可抑制促炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)宿主的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致Toll樣受體2(Toll-like receptors 2,TLR2)表達(dá)量降低，TNF-α的含量隨之降低[12]。這些都表明，干酪乳桿菌的使用可刺激小鼠產(chǎn)生抗炎作用，但其程度和機制存在菌株特異性[10]。Takeda K等[13]證明干酪乳桿菌Shirota株可通過乳制品的攝入而增強自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)活性。Compare D等[14]構(gòu)建了離體腸道微生物群，并對感染后腸應(yīng)激綜合征(post-infectious irritabIe bowel syndrome,PI-IBS)進(jìn)行了試驗分析。研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌在影響IBS癥狀上發(fā)揮了積極的作用，使用干酪乳桿菌DG株治療后顯著降低了所有促炎性細(xì)胞因子的mRNA以及Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR-4)蛋白的表達(dá)水平，同時增加了回腸和結(jié)腸中抗炎性因子IL-10的mRNA水平。

2.2 細(xì)胞免疫

干酪乳桿菌作為抗原入侵機體后可刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答，首先激活巨噬細(xì)胞等單核細(xì)胞，進(jìn)而通過增強T細(xì)胞或NK細(xì)胞活性來提高機體免疫力。研究發(fā)現(xiàn)，由干酪乳桿菌處理的Ercc1-/Δ7小鼠的腸系膜淋巴結(jié)的T細(xì)胞數(shù)顯著增加，動物體內(nèi)依賴T細(xì)胞免疫的特異性抗體也隨之增多，相比之下，對照組小鼠所產(chǎn)生的影響可忽略不計[15]。Dong H等[16]的研究已經(jīng)確定，干酪乳桿菌Shirota可促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞活性，激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，有效清除體內(nèi)被病毒感染的細(xì)胞，減少病毒復(fù)制，增加抗病毒抗體的含量。

2.3 體液免疫

干酪乳桿菌可提高哺乳小鼠體內(nèi)針對β清蛋白的抗體水平，增加對致敏紅細(xì)胞(sensitization red blood cell,SRBC)敏感的小鼠體內(nèi)的IgM含量?？诜衫胰闂U菌Shirota株的挪威鼠可產(chǎn)生抗原特異性遲發(fā)型超敏反應(yīng)，并增加血清中IgG2b的含量[17]。補充干酪乳桿菌的Ercc1- /Δ7小鼠，可在抗原攻擊后，促進(jìn)其血清中IgG2a的抗體滴度顯著增多[15]。

2.4 黏膜免疫

干酪乳桿菌誘導(dǎo)機體發(fā)生黏膜免疫應(yīng)答時，可通過小腸上皮細(xì)胞之間的甲基纖維素(methyl cellulose,MC)或上皮樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DC)兩種途徑到達(dá)腸組織固有層，然后活化Th2淋巴細(xì)胞，分泌大量的白介素-5(interleukin-5,IL-5)導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞活化，分泌特異性抗體IgA。特異性抗體IgA與腸黏膜上皮的分泌片特異性結(jié)合，從而形成黏膜表面抗體sIgA，進(jìn)而防止病原菌的黏附及入侵等[18]。宿主腸上皮屏障功能依賴于腸道緊密連接蛋白的水平和分布[19]，大多數(shù)干酪乳桿菌菌株可通過促進(jìn)該蛋白表達(dá)量的增加來增強腸上皮屏障功能[20]，通過增加炎癥受體(CD-206和TLR-2)的表達(dá)水平實現(xiàn)腸黏膜免疫系統(tǒng)的活化[21]。

3 干酪乳桿菌作為表達(dá)載體的應(yīng)用

與研究較為成熟的大腸埃希菌(Escherichiacoli)或巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)相比[22]，乳酸菌特別是乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)尚處于研究階段，其作為表達(dá)載體的獨特優(yōu)勢已成為近些年的研究熱點。乳酸菌作為公認(rèn)的食品級安全菌株，其構(gòu)建的重組菌株表達(dá)的蛋白無需經(jīng)過純化即可應(yīng)用于飼料添加劑等食品級用途[23]，使用其作為黏膜遞呈載體可以表達(dá)同源和異源蛋白質(zhì)[24]。許多研究者應(yīng)用干酪乳桿菌已成功表達(dá)了病毒、細(xì)菌及哺乳動物多種來源的異源蛋白。

干酪乳桿菌作為乳酸菌的一員，能夠耐受機體的防御機制，通過口服途徑攝入后，大部分菌體可耐受胃液、腸液的消化作用，在腸道內(nèi)大量存活，通過與腸道黏膜緊密接觸，起到調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)機體消化吸收的作用。同時某些菌株已被證實具有降血壓、降膽固醇，抗過敏，增強機體免疫等益生功能[25]，因此干酪乳桿菌作為活菌疫苗抗原遞呈載體越來越受到科研人員的重視[26]。除此之外，在誘導(dǎo)黏膜免疫方面，干酪乳桿菌比其他活疫苗載體如志賀菌，沙門菌和李斯特菌更具競爭力。目前，使用乳桿菌屬作為活疫苗遞送載體構(gòu)建的重組疫苗，已經(jīng)針對多種微生物抗原產(chǎn)生了黏膜免疫[27-28]。

人獸共患類疫病一直是危害包括人和各種的動物的重要病原體，其中產(chǎn)氣莢膜梭菌、流感病毒及產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌作為高發(fā)性病原菌一直是困擾研究人員的難點問題，而尋找一種有效的防控手段則成為目前的研究重點。

產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的α毒素是引起人、動物和家禽壞死性腸炎的重要毒力因子之一。通過構(gòu)建重組的干酪乳桿菌表達(dá)載體免疫小鼠后，其血清中IgG和IgA抗體與腸道中分泌的sIgA抗體水平明顯高于對照組，在此基礎(chǔ)上，宮旭穎[29]將產(chǎn)氣莢膜梭菌的4種主要外毒素α、β1、β2和ε同時插入干酪乳桿菌重組體系使4種異源蛋白同時表達(dá)，實現(xiàn)經(jīng)過1次免疫接種，就可同時預(yù)防多型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的疾病，證明了干酪乳桿菌重組體系對產(chǎn)氣莢膜梭菌高水平的保護(hù)效力。

針對甲型流感滅活疫苗刺激機體抗體水平大幅度下降的情況，Suebwongsa N等[30]通過構(gòu)建大腸埃希菌-干酪乳桿菌穿梭載體，改造干酪乳桿菌TISTR1341株成功表達(dá)甲型流感病毒的核衣殼蛋白，同時在對干酪乳桿菌TISTR1341株的克隆載體pRCEID-LC7.6的適用性研究中發(fā)現(xiàn)，新載體也能克隆和表達(dá)來自甲型流感病毒的核衣殼蛋白，為其成為口服免疫的黏膜遞呈載體提供有力依據(jù)[31]。在甲型流感病毒保守蛋白M2的研究中，Jimenez G S等[32]構(gòu)建了多種重組疫苗，包括表達(dá)M2融合蛋白的重組E.coli，表達(dá)M2蛋白的腺病毒載體，編碼M2的質(zhì)粒DNA等，其中每一個都能夠在小鼠體內(nèi)引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答，然而，這些基于M2蛋白的疫苗都存在免疫原性低的問題。研究發(fā)現(xiàn)，如果抗原可誘發(fā)黏膜免疫，將比體外免疫獲得更高的保護(hù)效力[33]。針對此現(xiàn)象，Chowdhury M Y等[34]融合交叉免疫的思路，采用與流感病毒同樣具有M2蛋白基因的霍亂毒素作為研究對象，并將編碼霍亂毒素M2蛋白的基因作為目的片段與干酪乳桿菌表達(dá)體系構(gòu)建重組載體免疫小鼠，口服免疫的小鼠體內(nèi)γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)表達(dá)水平明顯增高，通過鼻黏膜免疫可比口服免疫表現(xiàn)出更高的血清IgG和黏膜IgA表達(dá)水平。隨著研究的進(jìn)一步推進(jìn)，Suebwongsa N等[30]對甲型流感病毒核衣殼蛋白(NP)的密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，將優(yōu)化后的NP蛋白基因與干酪乳桿菌進(jìn)行重組，發(fā)現(xiàn)其可以改善異源蛋白表達(dá)效率低的問題，獲得更高水平的異源蛋白表達(dá)。

Liu J K等[35]將表達(dá)ETEC F41的重組干酪乳桿菌口服免疫小鼠，產(chǎn)生明顯的抗F41的IgG和sIgA抗體，且口服主動免疫組保護(hù)率達(dá)90%以上。Martín MC等[36]通過將Norwalk病毒VP60基因插入干酪乳桿菌構(gòu)成重組系統(tǒng)，同樣表現(xiàn)出了較高水平的保護(hù)效力。

以上這些結(jié)果都表明，較之前免疫手段相比，干酪乳桿菌重組載體的構(gòu)建，對以上幾種高發(fā)性的人獸共患疫病的發(fā)生提供了更好地抵抗效果，因此，該載體的進(jìn)一步研究成為了日后徹底消除此類疫病的希望所在。

豬腹瀉類疾病作為養(yǎng)豬行業(yè)的多發(fā)疾病，一直以來困擾著研究人員，而如何有效的防控此類疾病則成為目前研究的關(guān)注重點。

豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)主要通過腸道感染豬，在抗PEDV感染的免疫過程中，局部腸黏膜免疫系統(tǒng)發(fā)揮著不可替代的作用。葛俊偉等[37]通過將PEDV的中和抗原位點基因COE插入到干酪乳桿菌表達(dá)載體，構(gòu)建了表達(dá)PEDV中和抗原位點的重組干酪乳桿菌，以此獲得抗PEDV口服活載體疫苗，將其免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了高水平抗體IgG和黏膜抗體sIgA，并促進(jìn)產(chǎn)生淋巴細(xì)胞，與現(xiàn)有疫苗相比，在黏膜免疫方面具有明顯的優(yōu)越性。

豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)可引起仔豬嚴(yán)重腹瀉，病死率很高，Ho P S等[38]利用重組干酪乳酸桿菌表達(dá)傳染性胃腸炎病毒刺突狀糖蛋白以誘導(dǎo)特異性抗體，通過口服免疫小鼠，在其血清和腸液中檢測到高水平的針對TGEV的特異性IgG和IgA，使得接種疫苗的小鼠獲得了較好的免疫保護(hù)效果。王桂華等[39]將豬傳染性胃腸炎病毒S蛋白的抗原表位A片段插入到干酪乳桿菌表面表達(dá)載體pLA上，將構(gòu)建的pLA-A-GFP重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到干酪乳桿菌中，口服免疫小鼠，試驗組小鼠與照組相比，分別在免疫2周和3周后檢測出更高的IgG和sIgA，表現(xiàn)出較高的保護(hù)效力。

周晗等[40]通過將豬輪狀病毒主要免疫保護(hù)性抗原基因VP7和突變前非結(jié)構(gòu)蛋白4區(qū)(NSP4)基因定向插入到干酷乳桿菌表面，構(gòu)建了重組乳酸桿菌系統(tǒng)，通過口服方式免疫重組干酪乳桿菌后，在小鼠糞便、外生殖道沖洗液中均檢測到了特異性sIgA抗體，在小鼠血清中檢測到了特異性的IgG抗體。小鼠外生殖道和糞便中的sIgA以及血清IgG水平與對照組相比存在顯著差異。

以上研究表明，引起豬腹瀉類疫病的防控通過干酪乳桿菌重組疫苗的研究，已經(jīng)取得了極大的進(jìn)展，而這種主要從黏膜屏障上起防控作用的手段或許會是將來針對豬腹瀉類疫病預(yù)防的最佳方式。

幼禽免疫一般以口服或滴鼻點眼的手段為佳，但傳統(tǒng)疫苗采用該手段常造成免疫效力不佳的現(xiàn)象發(fā)生，因此促進(jìn)了以乳酸菌作為遞送載體的研究。

林紅麗等[41]利用干酪乳桿菌作為傳染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白的抗原遞呈載體，構(gòu)建了重組干酪乳桿菌，分別通過口服、滴鼻或點眼等方式免疫小鼠，在都可誘發(fā)免疫保護(hù)的情況下，口服組免疫效果明顯優(yōu)于其他兩組，且保護(hù)率高達(dá)83.3%。孫景秀等[42]證明新城疫病毒(NDV)HN蛋白重組干酪乳桿菌表達(dá)體系可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的雛雞黏膜免疫應(yīng)答。才冬杰等[43]構(gòu)建的J亞群禽白血病病毒gp85基因重組的干酪乳桿菌在免疫7周后，進(jìn)行攻毒保護(hù)性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組干酪乳桿菌pMG36e-gp85/L.casei免疫雛雞后能夠明顯增強體內(nèi)抗體水平；對照組病毒血癥平均檢出率為86%，而口服組和滴鼻組病毒血癥平均檢出率為40%和55.2%。結(jié)果表明，構(gòu)建的重組干酪乳桿菌pMG36e-gp85/L.casei對禽白血病病毒具有一定的抵抗力。付錦楠等[44]將編碼減蛋綜合征病毒的主要免疫保護(hù)性抗原纖維蛋白KnobS基因與大腸埃希菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)基因插入干酪乳酸桿菌分泌表達(dá)載體pMG36e-UP/L中，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，并可成功表達(dá)融合蛋白KnobS-LTB。構(gòu)建的干酪乳桿菌抗原遞呈載體不僅可以刺激產(chǎn)生先天性和特異性免疫應(yīng)答，還可以誘發(fā)高水平的黏膜免疫應(yīng)答，與其他抗原遞呈載體相比，表現(xiàn)出了更高的保護(hù)效率，從以上的研究可以發(fā)現(xiàn)，以干酪乳桿菌作為抗原遞呈載體可更好地彌補傳統(tǒng)疫苗的不足，從相關(guān)實例上更好地體現(xiàn)了干酪乳桿菌重組體系的應(yīng)用價值。

由上述研究成果可以看出，以干酪乳桿菌作為抗原遞呈載體研制出的疫苗，多以防治動物消化道疾病為主。當(dāng)其進(jìn)入機體刺激較強的黏膜免疫應(yīng)答，產(chǎn)生大量的sIgA的同時，還具有食品級的安全性保障，為臨床的實際應(yīng)用提供了可行性，具有極高的研究價值，與其他抗原遞呈載體相比具有一定優(yōu)勢。

4 小結(jié)

動物疾病的防治工作一直是研究工作者的關(guān)注重點，研究發(fā)現(xiàn)，動物患病多數(shù)因為病原體通過黏膜途徑侵入機體，如消化道、呼吸道和泌尿生殖道黏膜，從而導(dǎo)致動物染病，因此黏膜免疫對抵抗病原體入侵機體具有十分重要的意義[45]。黏膜免疫不僅可以產(chǎn)生IgG，還可以刺激產(chǎn)生大量的sIgA，sIgA的免疫屏障作用可阻隔病原菌的侵入或阻止病原菌與上皮細(xì)胞受體的結(jié)合，從而加強黏膜的抗感染能力[46]。已經(jīng)證明了干酪乳桿菌是有效的腸道益生菌，大量的試驗都表明了它的攝入可以刺激機體產(chǎn)生較高水平的特異性和非特異性免疫應(yīng)答，以提升動物機體免疫力。研究人員將干酪乳桿菌用作目的基因的抗原遞呈載體研制的重組疫苗，可以耐過胃液和腸液的酸堿環(huán)境，通過口服的方式免疫動物，操作方便、簡單且減少了動物因注射疫苗引起的應(yīng)激現(xiàn)象的發(fā)生，承載了抗原的干酪乳桿菌表達(dá)體系進(jìn)入機體后，可定植于腸道，產(chǎn)生傳統(tǒng)疫苗不能誘發(fā)的腸道黏膜免疫應(yīng)答，并長期存在于腸道，因此可作為引起腹瀉癥狀疾病預(yù)防和治療的首選方案。

由于對干酪乳桿菌作為抗原遞呈載體的研究仍在進(jìn)行中，所以亟需解決一些可能出現(xiàn)的實際問題，如干酪乳桿菌作為目的基因抗原遞呈載體制備的疫苗免疫效果是否與預(yù)期結(jié)果相符，以及對于其臨床應(yīng)用的實際效果如何仍需要更多的生產(chǎn)實踐來驗證，另外，干酪乳桿菌重組體系是否能規(guī)避免疫耐受現(xiàn)象也未經(jīng)證實，一旦證明干酪乳桿菌可作為抗原遞呈載體的實用性，它將因其自身優(yōu)勢而擁有廣闊的應(yīng)用前景。

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