凡納濱對蝦在二氧化碳麻醉無水?；钸^程中呼吸代謝及免疫的變化

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(1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088；2.廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江 524088)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦,肉嫩味美,具有較高的營養(yǎng)價(jià)值,深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。凡納濱對蝦以鮮銷和冷凍加工為主,其中鮮活蝦大約是冷凍蝦價(jià)格的兩倍,因此凡納濱對蝦的?；钸\(yùn)輸尤為重要。凡納濱對蝦的活體運(yùn)輸方法主要有帶水?；詈蜔o水保活兩種形式,其中無水?；钸\(yùn)輸操作簡便,運(yùn)載量大,成本低,有利于遠(yuǎn)距離的運(yùn)輸,具有廣闊的前景。無水?；羁梢酝ㄟ^使用麻醉劑麻醉水產(chǎn)品,使其進(jìn)入休眠狀態(tài)。由于二氧化碳(CO2)具有無毒、無殘留以及不影響水產(chǎn)品銷售的優(yōu)點(diǎn),因此CO2麻醉水產(chǎn)品進(jìn)行無水?；畛蔀橐粋€(gè)研究熱點(diǎn)[1]。凡納濱對蝦殼較薄,易受外界應(yīng)激影響造成傷亡,?；钸\(yùn)輸難度大,對其無水?；钛芯旷r有報(bào)道。

呼吸代謝是動(dòng)物能量代謝的基本生理活動(dòng),通過研究動(dòng)物呼吸代謝能夠了解動(dòng)物的代謝特征和適應(yīng)外界環(huán)境條件的能力[2]。環(huán)境因子大幅度波動(dòng)和代謝變化都會引起甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)變化,從而影響其健康狀況[3]。研究凡納濱對蝦無水?；畹暮粑x及免疫功能變化,了解其新陳代謝特點(diǎn),有助于完善?；罴夹g(shù),提高存活率。

本研究擬采用CO2麻醉凡納濱對蝦后于常溫下進(jìn)行無水?；?探討無水?；钸^程中對蝦呼吸代謝酶活力及免疫參數(shù)的變化規(guī)律,為凡納濱對蝦高值化開發(fā)利用以及長途運(yùn)輸提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

凡納濱對蝦誼林水產(chǎn)公司,隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體大小均一,約600尾凡納濱對蝦,質(zhì)量(14.1±1.5) g,體長(13.2±0.5) cm,實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分成6組,分別在6個(gè)65 L塑料箱內(nèi)暫養(yǎng)2 h,提供循環(huán)水流,水溫24 ℃,鹽度16‰,溶解氧>5 mg/L;泡沫盒(45.3 cm×45.3 cm×5 cm)、空運(yùn)專用箱子(49.8 cm×49.8 cm×31.5 cm)湛江機(jī)場服務(wù)公司;葡萄糖(Glucose,Glu)、檸檬酸、檸檬酸鈉均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

PHST-3F酸度計(jì)上海雷磁儀器廠;5810R冷凍離心機(jī)德國Eppendorf公司;Varioakan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀美國熱電公司;Cary 60紫外可見分光光度計(jì)安捷倫科技有限公司;HH·S21-8-S電熱恒溫水浴鍋上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司;Countstar IC1000自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上海睿鈺生物科技有限公司;CO2麻醉設(shè)備由CO2(99.9%)鋼瓶、減壓閥、氣石組成,自行組裝。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1凡納濱對蝦無水保活處理凡納濱對蝦暫養(yǎng)2 h后使用循環(huán)冷水機(jī)以2 ℃/h 降溫,使水溫達(dá)到18 ℃,再以1 L/min的流量向水中通入CO2至pH6.0,將蝦轉(zhuǎn)移到預(yù)先鋪有PU海綿和冰的泡沫盒(45.3 cm×45.3 cm×5 cm)內(nèi),每個(gè)泡沫盒裝載凡納濱對蝦約100尾。將泡沫盒用充氧的塑料袋密封后,裝入空運(yùn)專用箱子(49.8 cm×49.8 cm×31.5 cm),每箱裝載3盒,密封,置于28 ℃恒溫室下模擬凡納濱對蝦無水保活8 h。以未處理暫養(yǎng)狀態(tài)下的凡納濱對蝦為對照組,實(shí)驗(yàn)組分別在無水?；畹牡?、2、4、6 h以及置于水中充氧復(fù)蘇1 h后取樣。

1.2.2樣品采集

1.2.2.1對蝦鰓的采集用吸水紙吸干對蝦的體表水分后,在冰盤上迅速解剖,取鰓,裝入1.5 mL的離心管中,迅速放入-80 ℃冰箱保存。取0.1～0.3 g對蝦鰓組織,剪碎研磨,加入9倍的4 ℃生理鹽水(0.86%),制成10%組織勻漿液,恒溫4 ℃下,800×g離心10 min,取上清液分別測定己糖激酶(HK)、果糖磷酸激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和乳酸脫氫酶(LDH)等酶活力。

1.2.2.2對蝦血淋巴的采集取樣時(shí),用1 mL無菌注射器,按照血淋巴與抗凝劑(檸檬酸鈉:1.32%(m/v)檸檬酸:0.48%(m/v)Glu∶1.47%(m/v))1∶1的比例,從隨機(jī)挑選的對蝦腹面血竇中采集血淋巴。由于單尾對蝦的血淋巴量不足以測定全部免疫指標(biāo),因此,將同一時(shí)間點(diǎn)的對蝦血淋巴兩兩合并。所取的抗凝血,一部分直接用于血淋巴細(xì)胞總數(shù)(THC)測定;另一部分在4 ℃,700×g離心20 min,所得上清液用于測定葡萄糖(Glu)和乳酸(LD)濃度、超氧化歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活力。

1.2.3指標(biāo)測定

1.2.3.1呼吸代謝指標(biāo)測定Glu采用葡萄糖氧化酶法測定,LD采用比色法測定,PK、PFK、HK均采用紫外比色法測定,LDH采用微板法測定,SDH采用比色法測定[4-5]。

1.2.3.2免疫指標(biāo)測定SOD采用羥胺法測定,POD采用比色法測定,血淋巴細(xì)胞總數(shù)(THC)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)[4]。

1.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)中所得結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=5),數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行差異性分析,通過單因素方差(One-way ANOVA)及Duncan多重比較分析處理。

2　結(jié)果與分析

2.1　無水?；顚Ψ布{濱對蝦Glu和LD濃度的影響

凡納濱對蝦無水保活過程中Glu和LD濃度的變化如圖1(Ⅰ)、(Ⅱ)所示。

從圖1(Ⅱ)可看出:無水?；钸^程中,對蝦血糖濃度下降且均低于對照(p<0.05),在第6 h,血糖濃度降到最低值5.11 mmol/L;復(fù)蘇后,血糖濃度有所上升,但仍顯著低于對照(p<0.05)。Lorenzon等[6]研究指出,當(dāng)動(dòng)物承受較長時(shí)間應(yīng)激時(shí),血糖會下降。根據(jù)Barrento[7]報(bào)道,黃道蟹在經(jīng)過麻醉劑AQUI-S和浸泡冷海水處理后,血糖濃度呈現(xiàn)下降狀態(tài)。而在Trushenski[8]、Kuo[9]的研究中,經(jīng)過低溫、低氧或者麻醉劑應(yīng)激的凡納濱對蝦會出現(xiàn)高血糖癥。但本實(shí)驗(yàn)中血糖濃度一直下降,說明經(jīng)過CO2麻醉后無水?；钸^程中對蝦沒有出現(xiàn)高血糖癥,這可能是因?yàn)閷ξr加快Glu消耗以及啟動(dòng)代謝補(bǔ)償機(jī)制,以獲得更多能量來適應(yīng)環(huán)境脅迫[10]。無水?；顥l件下對蝦體內(nèi)Glu降低說明Glu的消耗加快。

從圖1(Ⅱ)可看出,無水?；顥l件下的對蝦體內(nèi)LD濃度從0 h開始顯著高于對照組(p<0.05),2 h達(dá)到最大值后下降,但在第6 h的濃度約為對照的1.6倍;復(fù)蘇后,LD濃度仍顯著高于對照(p<0.05)。麻醉后對蝦體內(nèi)的LD濃度較高,可能是CO2的刺激作用使對蝦LD濃度處于較高水平。因?yàn)镃O2本身是一種應(yīng)激介質(zhì),會擾亂水產(chǎn)品體內(nèi)酸堿平衡,導(dǎo)致LD積累[1]。Weber等[11]研究使用不同麻醉劑麻醉Senegalese sole(SoleasenegalensisKaup 1858)的應(yīng)激反應(yīng)時(shí)指出,麻醉劑能使LD濃度升高。而在無水保活的后期,對蝦進(jìn)行無氧代謝繼續(xù)生成LD。Samet等[12]研究斑節(jié)對蝦(Penaeusjaponicus)以及Bernardi等[13]研究美國龍蝦(Homarusamericanus)的無水?；顣r(shí),均認(rèn)為LD是無氧代謝的最終產(chǎn)物。

圖1　無水?；顚Ψ布{濱對蝦中Glu和LD濃度的影響Fig.1　Effects of waterless transportation on Glu and LD concentration of L. vannamei注:不同的字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖4同。

2.2　無水?；顚Ψ布{濱對蝦HK、PFK和PK活力的影響

糖酵解是生物體共同經(jīng)歷的Glu分解代謝的前期途徑。HK、PFK和PK是糖酵解限速酶,具有調(diào)節(jié)糖酵解途徑的作用,而且這三種酶活力會根據(jù)代謝情況受到轉(zhuǎn)錄的控制[14]。無水保活條件下凡納濱對蝦HK、PFK和PK活力的影響如圖2(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示。

在無水?；顥l件中,對蝦鰓HK、PFK和PK活力均高于對照,HK在第4 h達(dá)到峰值,并顯著高于對照(p<0.05);PFK活力在第2 h后顯著高于對照組(p<0.05),并同樣在第4 h達(dá)到峰值;PK活力一直顯著高于對照(p<0.05),在第6 h達(dá)到最大值。復(fù)蘇后,HK和PK活力恢復(fù)到對照組水平。三種關(guān)鍵酶活力均高于對照,說明無水?；顥l件下對蝦糖酵解速度加快,這與血糖下降的結(jié)果相吻合。遭受溫度下降脅迫時(shí),蝦(Farfantepenaeuspaulensis)大部分呼吸代謝酶活力會上升[15];在低氧條件下,凡納濱對蝦鰓中的HK、PFK轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)[16-17];溫度突變會使凡納濱對蝦PK酶活力發(fā)生變化[18]。這些都說明在脅迫條件下,凡納濱對蝦調(diào)整糖酵解速度使其能適應(yīng)變化[19],而糖酵解速度的加快是為了獲取更多能量[20]。無水?；顥l件下,對蝦的HK、PFK和PK活力升高說明凡納濱對蝦為了適應(yīng)不良環(huán)境加快糖酵解速度以獲得能量。

圖2　無水?；顚Ψ布{濱對蝦HK、PFK和PK活力的影響Fig.2　Effects of waterless transportation on HK,PFK and PK activity of L. vannamei

2.3　無水?；顚Ψ布{濱對蝦SDH和LDH活力的影響

SDH是三羧酸循環(huán)中唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜的酶,直接連在電子傳遞鏈上,影響生物體的氧化磷酸化作用,是有氧呼吸的關(guān)鍵酶[14]。LDH可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為LD,是無氧代謝的標(biāo)志酶。凡納濱對蝦無水?；钸^程中SDH和LDH含量的變化見如圖3(Ⅰ)、(Ⅱ)所示。

無水?；顥l件下對蝦SDH活力呈現(xiàn)下降趨勢,在第2 h顯著低于對照組(p<0.05),活力下降約14%。而LDH活力一直顯著高于對照組(p<0.05),6 h后酶活力顯著比對照組高約55%。SDH活力的下降可以歸結(jié)于外源性應(yīng)激[21],無水?；钸^程氧氣的供應(yīng)不足以及其他不良因素使SDH活力下降。當(dāng)有氧代謝受到抑制時(shí),無氧代謝是主要的供能途徑。如凡納濱對蝦受到低氧應(yīng)激時(shí),LDH同工酶轉(zhuǎn)錄上調(diào)[22]。無水?；钸^程中對蝦有氧代謝減弱,無氧代謝加強(qiáng),丙酮酸轉(zhuǎn)化為LD,釋放能量以繼續(xù)給機(jī)體提供能量。復(fù)蘇后,SDH和LDH活力都沒有恢復(fù)到對照組水平,與復(fù)蘇后LD濃度仍較高的結(jié)果相吻合,這可能與恢復(fù)時(shí)間較短或兩種酶的調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

圖3　無水?；顚Ψ布{濱對蝦SDH、LDH活力的影響Fig.3　Effects of waterless transportation on SDH,LDH activity of L. vannamei

2.4　無水?；顚Ψ布{濱對蝦THC、SOD和POD活力的影響

血淋巴細(xì)胞在甲殼動(dòng)物免疫系統(tǒng)中占重要地位,它主要承擔(dān)著細(xì)胞免疫[23]。THC在一定程度上反映機(jī)體的免疫應(yīng)激能力或健康狀況[24]。由圖4(Ⅰ)可知,?；钸^程中THC先降低后升高,在第4 h下降到最低點(diǎn)后略有回升。環(huán)境的改變會使海洋甲殼動(dòng)物的免疫系統(tǒng)發(fā)生改變,THC總是隨著甲殼動(dòng)物自身的生理狀況和外界環(huán)境條件變化而變化[25]。研究表明,當(dāng)凡納濱對蝦受到鹽度、銅離子、低氧或者溫度等脅迫時(shí),THC會下降[26-27]。無水保活條件下THC顯著低于對照(p<0.05),復(fù)蘇后THC有所增加但仍顯著低于對照組(p<0.05),說明在無水?；顥l件下,對蝦的細(xì)胞免疫力有所下降。

SOD及POD都是甲殼動(dòng)物體液免疫相關(guān)酶,其活力大小能反映機(jī)體的體液免疫機(jī)能。由圖4(Ⅱ)、(Ⅲ)可知,SOD與POD活力的變化一致:隨著?；顣r(shí)間延長,兩種酶活力增加。在第6 h,SOD活力比對照組高約56%。復(fù)蘇后,兩種酶活力與對照組沒有顯著差異。在保活第0 h,SOD和POD活力均顯著低于對照組,這可能是CO2麻醉應(yīng)激導(dǎo)致的[28]。而SOD和POD活力上升可能是對蝦體內(nèi)的氧化-抗氧化平衡沒有被打破,并出現(xiàn)呼吸爆炸,產(chǎn)生較多超氧陰離子,超氧陰離子的增多誘導(dǎo)SOD和POD活力的上升,以降低氧化損傷[28-29]。雖然無水?；钸^程中凡納濱對蝦的THC下降意味細(xì)胞免疫力下降,但SOD和POD活力上升說明體液免疫能發(fā)揮著清除自由基的作用[25]。復(fù)蘇后酶活力與對照沒有差異,說明在應(yīng)激下對蝦的體液免疫沒有受到嚴(yán)重的破壞,在?；詈笃谝约皬?fù)蘇后都能正常發(fā)揮作用。Mercier等[30]在研究凡納濱對蝦在遭受到持續(xù)應(yīng)激代謝與免疫變化時(shí),同樣發(fā)現(xiàn)THC下降,SOD活力上升的情況。

圖4　無水?；顚Ψ布{濱對蝦THC、SOD和POD活力的影響Fig.4　Effects of waterless transportation on THC,SOD and POD activity of L. vannamei

3　結(jié)論

本文初步研究了二氧化碳麻醉凡納濱對蝦無水?；? h過程中的呼吸代謝及免疫變化規(guī)律,證明8 h保活過程中對蝦通過有氧代謝轉(zhuǎn)變?yōu)闊o氧代謝獲取能量,維持正常生理代謝;免疫相關(guān)酶SOD和POD活力升高,細(xì)胞免疫正常發(fā)揮作用。對蝦機(jī)體的正常運(yùn)行,說明8 h的?；顣r(shí)長是可行的。本文可為對蝦?；顧C(jī)制提供理論參考。

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