DEAE-52纖維素靜態(tài)法分離純化樺褐孔菌多糖的工藝優(yōu)化

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(1.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東濟(jì)寧 273100; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

樺褐孔菌(Inonotusobliquus),又稱白樺茸(Chaga),是一種大型藥用真菌,主要寄生在樺樹上。樺褐孔菌中含有多糖、三萜類化合物、木質(zhì)素、黑色素、葉酸衍生物等多種生物活性成分[1]。從16世紀(jì)開始,俄羅斯、波蘭、芬蘭和其他東歐國家的居民就開始食用樺褐孔菌,用于防治多種疑難雜癥,如肝癌、胃癌、各類消化器官的癌癥、糖尿病、心臟病[2]。目前國內(nèi)外研究表明樺褐孔菌多糖具有抗腫瘤[3-4]、抗氧化[5-6]、抗血脂[7-8]、調(diào)節(jié)免疫力[9-10]、降血糖[11]等廣泛的藥理作用。但多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì),而是聚合程度不同的物質(zhì)混合物。多糖在單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量分布、結(jié)構(gòu)等方面具有不均一性,因此對(duì)多糖的分級(jí)純化是探討其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的基礎(chǔ)[12]。

目前常用超濾膜分離法[13]、凝膠色譜法[14]、分布沉淀分離法[15]、陰離子交換色譜法[16]和大孔樹脂柱色譜法[17]等方法分離純化多糖。其中,超濾膜分離法具有能耗低、分離效率高、不損害活性等優(yōu)點(diǎn),但膜在分離過程中易被污染,造成膜滲透通量下降,從而給多糖的分離增加難度[18]。凝膠色譜法是利用凝膠的分子篩作用,根據(jù)不同分子大小和形狀的多糖在層析柱中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離純化的目的,凝膠色譜分離純化效果好,但上樣量小,不適合作為分離純化的第一步驟進(jìn)行大量分離,主要用來進(jìn)行少量樣品的純化。分步沉淀法是利用“相似相溶 ”原理,用不同濃度的低級(jí)醇或酮將不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖沉淀出來,適用于溶解度相差較大的多糖的分離,有一定的局限性[19]。陰離子交換色譜以離子交換樹脂作為固定相,通過其表面帶電荷的基團(tuán)與樣品離子和流動(dòng)相離子的可逆交換、離子-偶極作用或吸附來實(shí)現(xiàn)色譜分離,可用來分離各種酸性、中性多糖和黏多糖,應(yīng)用廣泛。其中最常用的陰離子交換柱層析填料是DEAE-52纖維素,它既可純化多糖,還可分離各種多糖,已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域有效成分的分離與純化[20-21]。且本實(shí)驗(yàn)室前期用DEAE-52纖維素柱層析和Sephadex G-100柱層析分離純化樺褐孔菌子實(shí)體常溫水提粗多糖(Normal temperature water-extracted polysaccharides,NIOP),通過去離子水、0.2 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl洗脫,獲得了NIOP1(去離子水洗脫多糖)和NIOP2(0.2 mol/L NaCl洗脫多糖)兩種生物活性較好的分子量分布均一的多糖組分,但是DEAE-52纖維素柱層析分離純化多糖步驟繁瑣,工作量大,不易于短時(shí)間內(nèi)獲得大量單一多糖組分[22]。因此本實(shí)驗(yàn)通過研究DEAE-52纖維素對(duì)NIOP靜態(tài)吸附和解吸的影響,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)DEAE-52纖維素對(duì)NIOP靜態(tài)分離純化的目的。此方法操作方便,耗時(shí)少,為后期研究多糖的結(jié)構(gòu)及其活性研究提供了一定的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

樺褐孔菌子實(shí)體大興安嶺品味食品有限公司;DEAE-52纖維素Pharmacia公司;Sephadex G-100Waters公司;苯酚、硫酸等其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

TGL-16C型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;TU-1810型紫外分光光度計(jì)上海棱光科技有限公司;RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;TF-FD型冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;BT-200B型數(shù)顯恒流泵、BS-100A型自動(dòng)部分收集器中國上海滬西分析儀器廠;HCY-DA型全溫度搖床太倉市豪誠實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;1260 Infinity凝膠滲透色譜儀(Waters 2410示差折光檢測(cè)器)美國Agilent公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樺褐孔菌子實(shí)體多糖的制備準(zhǔn)確稱取一定量的樺褐孔菌子實(shí)體粉末,放入圓底燒瓶中,按照料液比為1∶30 g/mL加入蒸餾水,混合均勻,在室溫下浸提48 h,4000 r/min離心10 min,收集上清液。向上清液中加入4倍體積無水乙醇,在4 ℃下醇沉過夜。醇沉后,8000 r/min離心10 min,收集沉淀,50 ℃干燥后得NIOP。

1.2.2多糖含量測(cè)定以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn),通過苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[23]。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(2.0 mL,100 μg/mL)與1.0 mL苯酚溶液(6%)和5 mL硫酸混合。冷卻至室溫后,用紫外分光光度計(jì)在490 nm下測(cè)定吸光度(Abs)。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度Abs為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為y=10.56x+0.01,R2=0.9992,式中y為吸光值,x為葡萄糖濃度(mg/mL)。準(zhǔn)確吸取2.0 mL樣品溶液,按上述步驟在490 nm波長處測(cè)定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得,并計(jì)算相應(yīng)含量。

1.2.3DEAE-52的預(yù)處理將DEAE-52離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中約5 h,抽濾,在0.5 mol/L的HCl溶液中浸泡2 h后用去離子水洗至pH中性,抽干,加0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h,用去離子水將其洗至中性,并將其在抽濾漏斗中抽干。即得到了處理好的DEAE-52[24]。

1.2.4DEAE-52靜態(tài)吸附準(zhǔn)確稱取15 g處理后的DEAE-52纖維素,放入錐形瓶中,向其中加入20 mL的NIOP溶液。固定反應(yīng)條件為吸附轉(zhuǎn)速120 r/min、樣品濃度為40 mg/mL、吸附時(shí)間為90 min,研究不同吸附溫度(20、30、40、50 ℃)處理后的DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量影響;固定反應(yīng)條件為吸附溫度30 ℃、樣品濃度為40 mg/mL、吸附時(shí)間為90 min,考察不同吸附轉(zhuǎn)速(50、100、120、150、200、250 r/min)處理后的DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量影響;固定反應(yīng)條件為吸附轉(zhuǎn)速120 r/min、吸附溫度30 ℃、吸附時(shí)間為90 min,考察不同NIOP溶液濃度(20、30、35、40、50、60、70 mg/mL)處理后的DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量影響;固定反應(yīng)條件為吸附轉(zhuǎn)速120 r/min、樣品濃度為40 mg/mL、吸附溫度30 ℃,考察不同吸附時(shí)間(15、30、45、60、75、90、120、150 min)處理后的DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量影響。吸附量按下式公式計(jì)算。

式中,Q-為吸附量(mg/g);C1-初始濃度(mg/mL);C2-吸附后濃度(mg/mL);V-溶液體積(mL);W-DEAE-52纖維素質(zhì)量(g)。

1.2.5DEAE-52靜態(tài)解吸準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的DEAE-52纖維素加入錐形瓶?jī)?nèi),向其中加入濃度為40 mg/mL NIOP溶液(比例為:15 g纖維素加入20 mL NIOP粗多糖液),在30 ℃和120 r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩90 min。即得飽和吸附纖維,測(cè)定多糖吸附量,濾干備用。將吸附多糖后的飽和吸附纖維加入去離子水在30 ℃和120 r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩90 min,研究不同體積倍數(shù)(8、9、10、11、12、13、14、15、16)的去離子水對(duì)洗脫多糖濃度的影響。向經(jīng)去離子水處理后的飽和吸附纖維加入的0.2 mol/L NaCl溶液,在上述溫度和轉(zhuǎn)速下振蕩60 min,研究不同體積倍數(shù)(8、9、10、11、12、13、14、15、16)的0.2 mol/L NaCl溶液對(duì)洗脫多糖濃度的影響。向吸附多糖后的飽和吸附纖維加入12倍體積的去離子水后,將三角瓶放在在30 ℃和120 r/min后,研究不同洗脫時(shí)間(10、20、30、40、50、60、70、80、90、120 min)對(duì)洗脫多糖濃度的影響。向經(jīng)去離子水處理后的飽和吸附纖維,加入11倍體積的0.2 mol/L的NaCl,按上述處理方法,研究不同洗脫時(shí)間對(duì)洗脫多糖濃度的影響。洗脫率按下式公式計(jì)算。

式中,R-為洗脫率(%);P0-為上樣液起始濃度(mg/mL);P1-為吸附后上樣液濃度(mg/mL);P2-為洗脫后濃度(mg/mL);V1-為吸附液體積(mL);V2-為洗脫液用量。

1.2.6Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析分離純化多糖將經(jīng)預(yù)處理后的Sephadex G-100葡聚糖凝膠采用濕法裝柱,分別取NIOP1、NIOP2溶液上Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱(2.6 cm×70 cm),以蒸餾水洗脫,流速20 mL/h,每6 min收集一管,每管約2 mL。使用苯酚硫酸法測(cè)定每管多糖濃度。以管數(shù)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制洗脫曲線。

1.2.7凝膠滲透色譜測(cè)定多糖純度[25]色譜條件:色譜柱,Waters UllrallydrogelTM Linear(規(guī)格為7.8 mm×300 mm);流動(dòng)相,0.1 mol/L NaNO3溶液;流速,0.9 mL/min;柱溫,45 ℃。

1.2.8數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)中每個(gè)處理重復(fù)三次,采用Student’s test進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用origin 8.0軟件作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1　DEAE-52靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.1.1吸附溫度對(duì)DEAE-52纖維素靜態(tài)多糖吸附量的影響由圖1可知,溫度影響DEAE-52纖維素對(duì)吸附NIOP量隨溫度的升高呈現(xiàn)增大后減小的趨勢(shì),在20～30 ℃時(shí),DEAE-52纖維素對(duì)NIOP的吸附量隨著吸附溫度的升高而增大,但30 ℃之后,隨著溫度的升高,DEAE-52纖維素對(duì)NIOP的吸附量變小。這是由于吸附和解析均需活化能,且吸附的活化能小于解析的活化能,因此在低溫范圍內(nèi),吸附量隨溫度的升高而增大,高溫范圍內(nèi),吸附量隨溫度升高卻減小,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。因此選擇在30 ℃下吸附。

圖1　吸附溫度對(duì)DEAE多糖吸附量的影響Fig.1　Effect of adsorption temperature on the adsorbance of DEAE-52

2.1.2吸附轉(zhuǎn)速對(duì)DEAE-52纖維素靜態(tài)多糖吸附量的影響DEAE-52纖維素對(duì)NIOP的吸附量隨著吸附轉(zhuǎn)速的增大呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)。從圖2可知,DEAE-52在120 r/min時(shí)吸附量最大。當(dāng)轉(zhuǎn)速高于120 r/min時(shí),多糖的吸附量逐漸減小。這可能是因?yàn)檗D(zhuǎn)速增加了多糖液與DEAE-52纖維素接觸面積,吸附量增多,但是當(dāng)轉(zhuǎn)速過高時(shí)吸附的多糖可能被解吸到溶液中,導(dǎo)致吸附量減小[27]。因此選擇的吸附轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí),此時(shí)吸附效果最好。

圖2　旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速對(duì)DEAE-52多糖吸附量的影響Fig.2　Effect of rotate speed on the adsorbance of DEAE-52

2.1.3NIOP溶液濃度對(duì)DEAE-52纖維素靜態(tài)多糖吸附量的影響由圖3可知,DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量隨著樣品濃度的增大而提高。其中,當(dāng)NIOP溶液濃度達(dá)到40 mg/mL(多糖含量為6.3 mg/mL)時(shí),DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量為2.87 mg/g,但當(dāng)樣品濃度再增大時(shí),多糖的吸附量增加不明顯。這可能因?yàn)镈EAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附逐漸達(dá)到了飽和狀態(tài),對(duì)多糖的吸附量隨著NIOP溶液濃度的增大而增加不明顯,因此選擇40 mg/mL為NIOP溶液最適濃度。

圖3　樣品液多糖濃度對(duì)DEAE-52多糖吸附量的影響Fig.3　Effect of sample concentration of polysaccharides on the adsorbance of DEAE-52

2.1.4吸附時(shí)間對(duì)DEAE-52靜態(tài)多糖吸附量的影響由圖4可知,DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸附量隨著吸附時(shí)間的增長而提高。當(dāng)吸附時(shí)間為90 min時(shí),DEAE-52纖維素對(duì)多糖的吸收量為2.51 mg/g,但當(dāng)吸附時(shí)間再增長時(shí),多糖的吸附量增加不明顯。為了能高效的分離多糖,選擇吸附時(shí)間為90 min最為合適。

圖4　吸附時(shí)間對(duì)DEAE-52多糖吸附量的影響Fig.4　Effect of adsorption time on the adsorbance of DEAE-52

2.2　DEAE靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn)

2.2.1洗脫體積倍數(shù)對(duì)飽和吸附纖維NIOP洗脫多糖濃度的影響不同溶液洗脫體積倍數(shù)對(duì)飽和吸附纖維NIOP洗脫多糖濃度的影響結(jié)果見圖5和圖6。如圖所示,隨著洗脫體積倍數(shù)的增加,洗出的多糖的濃度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。其中NIOP1的最適洗脫體積為12倍體積,此時(shí)洗脫的多糖濃度為0.56 mg/mL(多糖質(zhì)量為11.17 mg),洗脫率為28.20%。而NIOP2的最適洗脫體積為11倍體積,此時(shí)洗脫的多糖的濃度為0.38 mg/mL(多糖質(zhì)量為7.55 mg),洗脫率為19.06%。在采用DEAE-52纖維素柱層析分離純化多糖時(shí),NIOP1的洗脫率約為28%,NIOP2的洗脫率約為20%,洗脫率相差不大[22]。

圖5　去離子水洗脫體積對(duì)DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.5　Effect of elution volume of deionized water on the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

圖6　0.2 mol/L NaCl 溶液洗脫體積對(duì)DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.6　Effect of elution volume of 0.2 mol/L NaCl solution on the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

2.2.2洗脫時(shí)間對(duì)飽和吸附纖維NIOP洗脫多糖濃度的影響洗脫時(shí)間對(duì)DEAE-52纖維素樹脂洗脫多糖濃度的影響結(jié)果見圖7和圖8。如圖所示,隨著洗脫時(shí)間的不斷增加,洗出的多糖濃度不斷增加,但洗脫時(shí)間達(dá)到一定數(shù)值后,隨時(shí)間的增加,洗脫的多糖濃度增加不明顯。為節(jié)約成本和時(shí)間,選擇的NIOP1和NIOP2的最適洗脫時(shí)間分別為90 min和60 min,此時(shí)洗脫的多糖濃度分別為0.55 mg/mL(多糖質(zhì)量為11.07 mg)、0.36 mg/mL(多糖質(zhì)量為7.18 mg),洗脫率分別為24.6%、15.6%。與之前DEAE-52纖維素柱層析分離多糖相比[22],洗脫率稍微有所下降,這是因?yàn)殡S著時(shí)間的不斷增加,仍能有少量多糖被洗出。

圖7　去離子水的洗脫時(shí)間對(duì)DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.7　Effect of elution time of deionized water on the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

圖8　0.2 mol/L NaCl 溶液洗脫時(shí)間對(duì)DEAE-52解吸附多糖濃度的影響Fig.8　Effect of elution time of 0.2 mol/L NaCl solutionon the release quantity of polysaccharide concentration of DEAE-52

2.3　Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱層析

如圖9和圖10中所示,NIOP1和NIOP2經(jīng)Sephadex G-100 葡聚糖凝膠柱層析均為單一洗脫峰,且各峰面積所示多糖分別占總多糖的63.65%、71.24%,其中多糖的回收率分別為:79.98%、81.45%,可以初步判斷洗脫所得多糖NIOP1和NIOP2均為分子量分布均一的多糖組分,但為進(jìn)一步檢驗(yàn)NIOP1和NIOP2的均一性,采用GPC對(duì)其均一性進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

圖9　NIOP1的Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析峰圖Fig.9　Sephadex G-100 column chromatography for NIOP1

圖10　NIOP2的Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析峰圖Fig.10　Sephadex G-100 column chromatography for NIOP2

圖11　葡聚糖凝膠色譜圖Fig.11　The GPC gel chromatography spectrum注:A:NIOP1;B:NIOP2。

2.4　NIOP1和NIOP2純度鑒定

由圖11可以看出NIOP1、NIOP2組分在GPC上呈現(xiàn)一單峰,保留時(shí)間分別為8.47 min和8.41 min平均相對(duì)分子量分別是24574、27901 Da。凝膠柱色譜圖與其相應(yīng)的SephadexG-100凝膠柱層析洗脫結(jié)果相一致,進(jìn)一步說明NIOP1和NIOP2具有較強(qiáng)的均一性分布。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)的靜態(tài)研究得出了最佳靜態(tài)吸附和解吸條件,實(shí)驗(yàn)表明,DEAE-52纖維素在NIOP濃度為40 mg/mL,溫度30 ℃,120 r/min轉(zhuǎn)速下處理90 min時(shí)對(duì)NIOP的吸附效果最佳。而飽和吸附纖維最佳解吸條件是:NIOP1洗脫劑用量為12倍體積,洗脫時(shí)間為90 min;NIOP2洗脫劑用量為11倍體積,洗脫時(shí)間為60 min。且DEAE-52纖維素靜態(tài)洗脫出的多糖NIOP1和NIOP2均為分子量均一分布的多糖,與前期動(dòng)態(tài)洗脫多糖結(jié)果一致。與動(dòng)態(tài)洗脫相比,DEAE-52纖維素靜態(tài)吸附耗時(shí)少,操作簡(jiǎn)單,而且對(duì)NIOP具有良好的分離純化效果,為后期大量制備多糖提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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