鐮形艾美耳球蟲感染早期對小鼠的致病性研究

賈妮娜，袁順子，車麗霞，張麗萍，楊雯，任超

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鐮形艾美耳球蟲感染早期對小鼠的致病性研究

賈妮娜，袁順子，車麗霞，張麗萍，楊雯，任超通信作者

（天津農學院 動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384）

為研究鐮形艾美耳球蟲感染早期對小鼠的致病性，將鐮形艾美耳球蟲經口感染小鼠，同時設立無球蟲感染空白對照組。通過觀察各組小鼠的臨床癥狀，感染36 h后剖檢的眼觀病變，以及各個臟器的病理組織學觀察和盲腸免疫組化觀察，來研究感染早期鐮形艾美耳球蟲對小鼠的致病性。結果表明：早期感染鐮形艾美耳球蟲主要破壞腸道的黏膜組織，導致黏膜上皮和腺上皮細胞變性、壞死、脫落，黏膜下層水腫，炎性細胞浸潤至黏膜層，對其他臟器未造成可見的病理損傷；免疫組化觀察，發(fā)現(xiàn)早期感染鐮形艾美耳球蟲也主要侵染黏膜層和黏膜下層。因此，鐮形艾美耳球蟲僅感染小鼠的盲腸，不感染其他器官，可以作為候選的疫苗載體。

鐮形艾美耳球蟲；致病性；小鼠；器官指數(shù)；免疫組化；病理組織切片

研究發(fā)現(xiàn)，艾美耳球蟲生物安全性較高，寄生宿主的特異性強，遺傳性狀穩(wěn)定，通過人工轉染能夠表達外源抗原，可持續(xù)傳代并穩(wěn)定表達目的抗原，激發(fā)局部黏膜免疫和系統(tǒng)性免疫反應[1-2]。鑒于艾美耳球蟲具有上述優(yōu)勢，在禽免疫學上已利用柔嫩艾美耳球蟲（）和緩艾美耳球蟲（）作為抗原載體，研究外源抗原被有效運送、遞呈，進而產生保護性免疫應答的細胞與分子生物學機制[3-5]。感染哺乳動物的球蟲，如感染家兔的斯氏艾美耳球蟲（），也可以作為抗原載體通過人工轉染途徑穩(wěn)定表達外源抗原[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的鼠球蟲有15種，鐮形艾美耳球蟲（）是其中的一種，它主要感染小鼠盲腸和結腸的黏膜組織[7]。鐮形艾美耳球蟲能夠在小鼠體內大量繁殖，未來有望成為一類新型疫苗載體，具有廣闊的應用前景。因此，本研究通過建立鐮形艾美耳球蟲感染小鼠的動物模型，研究感染早期鐮形艾美耳球蟲對小鼠各個臟器的致病性，以及鐮形艾美耳球蟲抗原的組織分布，為新型獸用疫苗載體的研究提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

昆明系小鼠60只，購自天津醫(yī)科大學實驗動物中心，9 周齡，體重為（25±2）g，飼料充足，飲水不限，分籠飼養(yǎng)，室溫，濕度適宜。

1.1.2 主要試劑

生物素標記的山羊抗雞IgY二抗購自艾美捷科技有限公司；HRP標記的鏈霉卵白素復合物購自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司。

1.1.3 蟲株

鐮形艾美耳球蟲由中國農業(yè)大學國家動物寄生原蟲實驗室贈予，天津農學院基礎獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組與處理

將9周齡雌性清潔級昆明小鼠20只分成2組，每組10只，試驗組小鼠經口感染鐮形艾美耳球蟲5×104個/只，對照組灌服等量生理鹽水。感染后觀察并記錄各組小鼠的精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀。

1.2.2 剖檢與病理組織學觀察

將感染36 h后的小鼠剖檢，觀察各組小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸的病變情況，計算器官指數(shù)（各臟器重量與體重之比）。采集各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、盲腸組織，用4%甲醛溶液進行固定，經過7 d的組織固定，將各組小鼠的臟器進行常規(guī)病理組織切片制備與HE染色，光鏡下觀察各臟器的病理變化。“-”表示無病變，“＋”表示輕度損傷，“＋＋”表示中度損傷，“＋＋＋”表示重度損傷。

1.2.3 免疫組織化學觀察

石蠟切片按常規(guī)進行脫蠟處理至蒸餾水，之后PBS洗3次，每次5 min；5%雙氧水室溫避光孵育20 min，去除內源性過氧化物酶，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清室溫封閉30 min；棄去血清，滴加雞抗鐮形艾美耳球蟲全抗原一抗（工作濃度為1∶2 000），37 ℃孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素標記的山羊抗雞IgY二抗（工作濃度為1∶1 000），37 ℃孵育1 h，之后PBS洗3次，每次5 min；滴加HRP標記的鏈霉卵白素復合物，37 ℃孵育30 min，之后PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB顯色液，室溫顯色10 min；用蒸餾水終止顯色；放入蘇木素中復染30 s；蒸餾水沖洗后鹽酸酒精分色10 s；自來水反藍5 min；按HE染色步驟進行脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀觀察

在感染鐮形艾美耳球蟲36 h內，試驗組與對照組小鼠的精神、活動、食欲、排泄、皮毛等臨床癥狀均無異常。

2.2 病理剖檢觀察

感染36 h后剖檢觀察各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟，試驗組與對照組相比，各臟器的形狀、大小與色澤均正常，未見病變情況，且各臟器的器官指數(shù)差異不顯著（表1）。對盲腸剖檢，觀察可見試驗組黏膜腫脹、有少量出血點，黏膜表面覆蓋多量黏液。試驗組與對照組相比，小鼠的盲腸指數(shù)差異顯著（表1）。

表1 各組小鼠的器官指數(shù) %

注：*表示差異顯著（＜0.05）

2.3 病理組織學觀察

感染36 h后試驗組與對照組相比，小鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟的病理組織學觀察未見異常，差異不顯著（表2，圖1A-H）。

表2 各組小鼠器官病理學檢查結果

感染36 h后試驗組與對照組相比，試驗組小鼠的盲腸黏膜上皮和腺上皮變性、壞死、脫落，大量炎性細胞浸潤，黏膜下層水腫、增寬，對照組的病理組織學觀察未見異常（表3，圖1I-J）。

表3 各組小鼠盲腸病理學檢查結果

注：A：試驗組心臟病理組織切片圖（100×）；B：對照組心臟病理組織切片圖（100×）；C：試驗組肝臟病理組織切片圖（100×）；D：對照組肝臟病理組織切片圖（100×）；E：試驗組脾臟病理組織切片圖（100×）；F：對照組脾臟病理組織切片圖（100×）；G：試驗組腎臟病理組織切片圖（100×）；H：對照組腎臟病理組織切片圖（100×）；I：試驗組盲腸病理組織切片圖（100×）；J：對照組盲腸病理組織切片圖（100×）

2.4 免疫組織化學觀察

感染36 h后試驗組與對照組相比，鐮形艾美耳球蟲陽性區(qū)域主要分布在黏膜上皮、固有層、黏膜下層和腸腔中，對照組未見鐮形艾美耳球蟲陽性區(qū)域（圖2）。說明鐮形艾美耳球蟲在早期主要侵染小鼠盲腸的黏膜層和黏膜下層。

圖2 各組盲腸免疫組化圖

注：A：試驗組盲腸免疫組化圖（100×）；B：對照組盲腸免疫組化圖（100×）

3 討論

鐮形艾美耳球蟲隸屬于頂復門（Apicomplexa）、孢子蟲綱（Sporozoasida）、球蟲亞綱（Coccidiasina）、真球蟲目（Eucoccidiorida）、艾美耳亞目（Eimeriorina）、艾美耳科（Eimeriidae）、艾美耳屬（），潛隱期為7 d，癥狀明顯期10～16 d[7-8]。卵囊經口感染后，先在體內進行無性生殖，感染16 h后，盲腸和結腸的腸腺上皮細胞內含有成熟的第一代裂殖體；感染32 h后，盲腸和結腸的腸腺上皮細胞內有第二代裂殖體[8]。研究發(fā)現(xiàn)，感染36 h后，鐮形艾美耳球蟲的蟲體不斷進行無性繁殖，對盲腸的腸黏膜造成損傷，導致黏膜上皮和腺上皮細胞變性、壞死、脫落，黏膜下層水腫，炎性細胞浸潤至黏膜層（圖1I-J）。對于其他器官，沒有發(fā)現(xiàn)眼觀和鏡檢的可見病理變化（圖1A-H）。免疫組化觀察，發(fā)現(xiàn)鐮形艾美耳球蟲早期感染也主要侵染盲腸的黏膜層和黏膜下層（圖2）。這些都與前人的研究相符合，說明鐮形艾美耳球蟲早期感染的主要部位是盲腸，造成小鼠腸道黏膜層的嚴重損傷，其他器官不存在損傷，可以作為候選的疫苗載體進行研究。

艾美耳球蟲用作疫苗活載體具有以下幾方面優(yōu)勢：第一，相對于病毒和細菌，艾美耳球蟲基因組較大，約60 Mb[9]，可供外源基因插入的潛在位點較多。Su等利用轉座子對柔嫩艾美耳球蟲進行轉染，獲得了穩(wěn)定轉染球蟲群體，并且通過genome-walking的方法發(fā)現(xiàn)插入位點具有TTAA特征，進一步從基因水平解析球蟲作為疫苗載體的價值[10]。第二，艾美耳球蟲是真核生物，可以像宿主細胞對表達出的外源蛋白進行化學化修飾，而不影響蛋白的抗原活性。Kurth等對大鼠尼氏球蟲（）進行了體外瞬時轉染和體內穩(wěn)定轉染，并利用柔嫩艾美爾球蟲的MIC-1調控序列實現(xiàn)了黃色熒光蛋白和藥物篩選基因DHFR在鼠球蟲中的轉染[11]。第三，球蟲活卵囊疫苗已經商品化，能夠激發(fā)宿主產生良好的群體免疫保護效果（保護率＞90％[12]）。第四，球蟲疫苗可口服接種，簡單易行，適用大規(guī)模的群體飲水或拌料免疫。第五，球蟲的繁殖周期較短，感染屬于自限性，在生成卵囊以后即排到體外，不會引起免疫耐受問題，且生物安全性較高，不存在跨種間傳播的威脅，田間應用時也不會出現(xiàn)所謂“散毒”的局面。第六，球蟲寄生于腸上皮細胞內，不同階段蟲體對腸黏膜上皮細胞反復入侵，能激發(fā)宿主產生較強的黏膜免疫和細胞免疫應答，不僅能夠激發(fā)宿主對球蟲表達的外源蛋白產生免疫反應，而且也能使宿主產生針對球蟲自身的免疫反應，起到一苗多用的效果[1-4]。此外，艾美耳球蟲感染能夠激活宿主腸道上調TLR1LA、TLR3、TLR4、TLR5、TLR15、TLR21的表達，并啟動 MyD88 信號通路來誘導先天性免疫應答[13-15]。因此，艾美耳球蟲作為一種新型的模式生物，具有活疫苗載體的功能，通過改造鐮形艾美耳球蟲的致病基因，減輕對宿主腸道的損傷，使鐮形艾美耳球蟲成為一種新型抗原載體，用于進一步研究抗原與宿主免疫細胞之間的相互作用，具有更為廣闊的應用前景。

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責任編輯：宗淑萍

On the pathogenicity of early infection ofin mice

JIA Ni-na, YUAN Shun-zi, CHE Li-xia, ZHANG Li-ping, YANG Wen, REN ChaoCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to study the pathogenicity of early infection ofin mice,was invading by oral infection in the treatment group, while the control group was established with non-coccidia infection. Then the clinical symptoms, autopsy lesions, organ index, organ pathological histology and immunohistochemical characterization of cecum were observed for 36 hours to learn about the pathogenicity of early infection ofin mice. The results showed that in the early stage of infection,maily damaged mucosal tissues of intestinal tract which caused degeneration, necrosis and shedding of epithelial and glandular epithelial cells, edema in strata submucosum, inflammatory cells infiltrating the mucosa but no visible pathological damage to other organs. According to immunohis chemical observation, the infections of mucosa and submucosa in the early stage were also observed. Hence,will be a candidate vaccine vector, which did not damage all the organs except cecum.

; pathogenicity; mice; organ index; immunohistochemistry; histopathological sections

S852.72+3

A

1008-5394（2018）01-0054-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.01.012

2017-04-25

大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201610061008，201710061045）；天津農學院高校教師教育改革創(chuàng)新引導發(fā)展項目（20171003）；國家自然科學基金重點項目（31330076）

賈妮娜（1996-），女，本科在讀，研究方向為基礎獸醫(yī)學。E-mail：820369011@qq.com。

任超（1986-），女，實驗師，碩士，研究方向為基礎獸醫(yī)學。E-mail：chaoren04050110@163.com。