鎘污染對(duì)文冠果土壤微生物的影響

江　偉， 于小飛， 田永蘭， 柴　陽， 熊元武， 鐘　馨， 張化永

(華北電力大學(xué)工程生態(tài)學(xué)與非線性科學(xué)研究中心，北京 102206)

土壤重金屬污染已經(jīng)成為一個(gè)世界性問題，在當(dāng)代科學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注[1-2]。據(jù)報(bào)道，由于工業(yè)廢水不合理排放、農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品不合理使用、含鎘磷肥的使用以及汽車尾氣排放等，我國農(nóng)業(yè)主產(chǎn)區(qū)土壤中的鎘含量已經(jīng)有明顯的積累現(xiàn)象[3]。鎘污染對(duì)我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有重要影響，首先，農(nóng)作物從受污染土地中吸收鎘，農(nóng)作物生長發(fā)育受到抑制，產(chǎn)量大幅降低[4]。其次，土壤鎘污染也會(huì)使農(nóng)產(chǎn)品中的重金屬鎘含量超標(biāo)，而使植物蛋白質(zhì)、葉綠素、糖、維生素C等含量降低[5]。因此，如何有效地處理土壤中的鎘污染，已經(jīng)成為近年來環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域的突出問題。

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)屬于無患子科文冠果屬，落葉小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，在草沙地、撂荒地、多石的山區(qū)、黃土丘陵和溝壑等處，甚至在崖畔上都能正常生長發(fā)育。在我國的分布范圍為8°37′～47°20′N、73°20′～120°25′E，遍布華北、華東及西北地區(qū)。其種子含油率高達(dá)74%，由文冠果籽油制備的生物柴油相關(guān)烴脂類成分含量高，內(nèi)含18C的烴類占93.4%，且無硫、氮等因子污染環(huán)境，符合現(xiàn)行的優(yōu)質(zhì)生物柴油指標(biāo)，是北方理想的木本油料樹種[6]。

針對(duì)鎘污染日益嚴(yán)重的現(xiàn)狀，植物修復(fù)技術(shù)成為一種新型的、低成本的、環(huán)境友好的解決土壤鎘污染問題的手段，尤其適合發(fā)展中國家。利用文冠果來修復(fù)重金屬鎘污染土壤，再將收獲的文冠果果實(shí)用于生物柴油的生產(chǎn)，既可以改善環(huán)境質(zhì)量，又可以實(shí)現(xiàn)資源化。有研究表明，文冠果對(duì)鎘污染具有較高的耐受性，其生長過程中的株高、莖粗、生物量等僅在土壤中鎘達(dá)到200 mg/kg時(shí)才受到顯著抑制[7]。截至目前，對(duì)文冠果生長過程中土壤微生物的變化與重金屬之間關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，而文冠果種植地區(qū)的土壤污染卻不容忽視，其在生物能源產(chǎn)出和土壤污染修復(fù)方面的作用會(huì)在未來能源環(huán)境領(lǐng)域逐漸凸顯。

本研究采用溫室盆栽試驗(yàn)，通過長期試驗(yàn)，考察不同生長期下的文冠果土壤微生物對(duì)重金屬鎘的響應(yīng)，采用Biolog Eco微平板研究人工污染土壤中外源鎘不同濃度對(duì)土壤微生物活性與功能多樣性的影響，以期為實(shí)現(xiàn)能源木本植物修復(fù)鎘污染土壤提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選取的文冠果購自河南省洛陽市嵩縣綠源綠化種苗科研有限公司。

供試土壤采自北京農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田，土壤為黃褐土。取0～20 cm表層土壤，新鮮土樣去除植物殘?bào)w、礫石等，自然風(fēng)干，過2 mm篩備用，土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1　土壤基本理化性質(zhì)

1.2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)鎘濃度梯度：0、10、50、100 mg/kg(以純鎘計(jì))，文冠果種子經(jīng)浸泡發(fā)芽后移栽到裝有7 kg含有不同濃度的鎘污染土壤的花盆中，每盆定苗2株，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，溫室中培養(yǎng)，整個(gè)生長過程用自來水澆灌以維持田間持水量約為60%。盆栽試驗(yàn)于2009年5月中旬開始，在2009年7月19日、2009年9月14日、2009年11月12日等3個(gè)生長期時(shí)間點(diǎn)取樣。樣品采集時(shí)，在距植株主干8 cm處挖取2個(gè)直徑為2.5 cm、深12 cm的土樣，混合組成樣品。采集的新鮮土樣過2 mm網(wǎng)篩，一部分土樣放在4 ℃冰箱保存，供微生物指標(biāo)分析；另一部分土樣自然風(fēng)干，供土壤基本理化性狀測(cè)定。

1.3　測(cè)定方法

1.3.1土壤微生物群落功能多樣性分析本試驗(yàn)采用Shannon指數(shù)(H)和Gini系數(shù)(G)反映不同處理下土壤微生物多樣性的差異。Shannon指數(shù)是反映群落豐富度和分布均勻程度的綜合指標(biāo)，是目前應(yīng)用最為廣泛的群落多樣性指數(shù)之一。Gini系數(shù)表示微生物的均勻度，G介于0～1之間，當(dāng)G=0時(shí)表示微生物群落分布絕對(duì)均勻，當(dāng)G=1時(shí)表示微生物群落分布絕對(duì)不均勻。

1.3.2Biolog Eco微平板本研究中功能多樣性的測(cè)定采用基于Biolog Eco微平板的碳素利用法，具體操作過程如下：將Biolog Eco微平板從冰箱內(nèi)取出，25 ℃預(yù)熱15 min。稱取相當(dāng)于5 g烘干土壤質(zhì)量的新鮮土樣，加入內(nèi)有45 mL 0.85% NaCl溶液(質(zhì)量濃度)的三角瓶中，用8層紗布封口，在 200 r/min 搖床中振蕩30 min。手搖數(shù)秒后，迅速用滅菌的吸管吸取1 mL土壤懸液，加入內(nèi)有9 mL 0.85% NaCl溶液的試管中，手搖數(shù)秒后，迅速用滅菌的吸管吸取2 mL土壤懸液，加入內(nèi)有18 mL 0.85% NaCl溶液的試管中得到10-3稀釋液。用自動(dòng)多頭移液器接種，接種量為150 μL/孔。將接種好的測(cè)試板加蓋在25 ℃下保濕暗培養(yǎng)10 d，每隔12 h用Biolog自動(dòng)讀數(shù)裝置在590 nm下測(cè)定吸光度[8]。

平均顏色變化率[9](average well color development，簡稱AWCD)的表達(dá)式為AWCD=[∑(Ci-R)]/31，其中Ci是除對(duì)照孔外所測(cè)得31個(gè)反應(yīng)孔的吸光度，R是對(duì)照孔的吸光度。

1.4　數(shù)據(jù)分析

為了避免接種密度帶來的差異，本研究運(yùn)用AWCD接近0.6時(shí)的數(shù)據(jù)計(jì)算多樣性指數(shù)，進(jìn)行主成分分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007處理，相關(guān)性分析、方差分析以及主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)分析采用軟件SPSS 16.0及Matlab 7.0實(shí)現(xiàn)。本試驗(yàn)中，對(duì)數(shù)據(jù)先進(jìn)行泰勒轉(zhuǎn)換或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行主成分分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　鎘污染對(duì)文冠果土壤微生物活性的影響

土壤微生物接種到Biolog Eco微平板后，微生物利用板中的碳源使指示劑變色，隨著碳源消耗量的增加指示劑顏色加深，從而相應(yīng)碳源的吸光度增大。AWCD表征微生物群落碳源利用率，是土壤微生物群落利用單一碳源能力的一個(gè)重要指標(biāo)，反映了土壤微生物的整體活性。

AWCD的變化曲線分3個(gè)變化階段，滯后期、對(duì)數(shù)增長期和穩(wěn)定期。由圖1可知，在文冠果的第1生長期(或拔節(jié)期)，與空白對(duì)照相比，10 mg/kg鎘對(duì)土壤微生物群落總體活性影響不大，50、100 mg/kg鎘使土壤微生物活性降低。在第2生長期，10 mg/kg鎘使微生物活性明顯增加，而50、100 mg/kg 鎘對(duì)其影響不大。在第3生長期，各處理組表現(xiàn)出與第1生長期相似的趨勢(shì)。

生長期對(duì)微生物的活性也有一定的影響，隨著生長時(shí)間的延長，空白對(duì)照及50、100 mg/kg鎘處理中土壤微生物的活性變化趨勢(shì)均表現(xiàn)為先下降后上升，10 mg/kg鎘處理的趨勢(shì)與之相反，表現(xiàn)為先上升后下降。鎘污染濃度為10 mg/kg時(shí)，第2生長期的AWCD最高，而其他處理則表現(xiàn)為第1生長期的AWCD最高，第2生長期的AWCD低于其他2個(gè)生長期。

2.2　鎘污染對(duì)文冠果土壤微生物多樣性的影響

從表2可以看出，在文冠果的整個(gè)生長過程中，當(dāng)鎘的濃度為100 mg/kg時(shí)，Shannon指數(shù)(土壤微生物的豐富度、均勻度)最高，方差分析結(jié)果表明，這種差異并不顯著。對(duì)文冠果Gini指數(shù)(土壤微生物活性)的分析發(fā)現(xiàn)，在第2生長期，當(dāng)鎘的濃度為10 mg/kg時(shí)，土壤微生物活性最高，而此時(shí)微生物的豐富度、均勻度最低，表明在該濃度鎘污染下，微生物的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，鎘耐性微生物成為優(yōu)勢(shì)種，鎘敏感微生物種群降低。

表2　不同處理下文冠果土壤微生物功能多樣性指數(shù)

注：表中數(shù)據(jù)為3個(gè)樣品的平均值。每列數(shù)據(jù)后不同大寫字母、每行數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　鎘污染對(duì)文冠果土壤微生物代謝圖譜的影響

由圖2-A可知，應(yīng)用主成分分析法在31個(gè)主成分中提取的2個(gè)主成分因子，分別可以解釋原變量特征的26.84%、25.27%。用第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)作圖表征文冠果第1生長期土壤中微生物的代謝特征。主成分得分系數(shù)的方差分析結(jié)果表明，PC1得分系數(shù)差異顯著(F3，8=6.196，P=0.018<0.05)。這種差異主要表現(xiàn)在圖2-A中 100 mg/kg 鎘處理的微生物群落落在PC1正方向，對(duì)照、10 mg/kg 鎘處理的微生物群落位于PC1的負(fù)方向，50 mg/kg鎘處理的微生物群落居中，說明100 mg/kg鎘處理與對(duì)照及10 mg/kg鎘處理差異顯著。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，D-纖維二糖、α-D-乳糖、i-赤蘚糖醇、D，L-α-磷酸甘油、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等與PC1正相關(guān)，衣康酸、丙酮酸甲酯、L-天門冬酰胺、吐溫-80等與PC1負(fù)相關(guān)。

文冠果第2生長期土壤中微生物的代謝特征見圖2-B，得分系數(shù)的方差分析結(jié)果表明，PC1得分系數(shù)差異極顯著(F3，8=12.556，P=0.002<0.01)。這種差異主要表現(xiàn)在圖2-B中10 mg/kg鎘處理的微生物群落落在PC1負(fù)方向，對(duì)照及50 mg/kg鎘處理的微生物群落位于PC1的正方向，說明10 mg/kg鎘處理與對(duì)照及50 mg/kg鎘處理之間差異極顯著，而對(duì)照及50、100 mg/kg鎘處理之間并無顯著性差異，以上結(jié)果表明與空白對(duì)照相比，高濃度的鎘污染并沒有改變微生物群落碳源利用的功能多樣性，證明文冠果土壤微生物對(duì)鎘污染具有一定的耐受性，在鎘污染條件下仍可以保持特定的活性能力。通過主成分分析發(fā)現(xiàn)，α-D-乳糖、D-木糖/戊醛糖、i-赤蘚糖醇、D-甘露醇、N-乙酰-D葡萄糖氨、D-葡糖胺酸、L-絲氨酸等與PC1正相關(guān)，說明10 mg/kg鎘濃度的土壤中，微生物降低了對(duì)上述碳源的利用率。而衣康酸、糖苷與PC1負(fù)相關(guān)，表明10 mg/kg鎘濃度的土壤中，微生物增加了對(duì)這些碳源的利用率。

文冠果第3生長期土壤中微生物的代謝特征見圖2-C，PC1、PC2得分系數(shù)的方差分析結(jié)果表明，各處理之間得分系數(shù)差異不顯著(PC1：F3，8=2.197，P=0.166>0.05，PC2：F3，8=0.328，P=0.810>0.05)。說明在第3生長期土壤微生物群落沒有顯著變化，這與AWCD變化一致，這可能是由于交換態(tài)鎘會(huì)隨時(shí)間的延續(xù)而逐漸減小所造成的。

3　結(jié)論與討論

微生物是土壤中生物量最大、種類最豐富的類群，對(duì)于重金屬污染，土壤微生物與其直接接觸、關(guān)系密切，與植物相比微生物對(duì)污染物的反應(yīng)更加靈敏。曾路生等在水稻盆栽條件下，添加外源鎘，發(fā)現(xiàn)鎘濃度較低時(shí)，土壤微生物量碳和氮與鎘濃度呈正相關(guān)關(guān)系，而較高的鎘濃度使二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，鎘濃度的轉(zhuǎn)折點(diǎn)因土壤性質(zhì)有所差異[10]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的當(dāng)鎘濃度為 10 mg/kg 時(shí)可以提高微生物的生物量，增加微生物代謝活性的結(jié)論與之相一致。本研究中，高濃度的鎘污染對(duì)文冠果土壤微生物的影響不大，說明文冠果對(duì)重金屬鎘具有一定的耐受性。隨著生長期的延長，在第3生長期，鎘污染對(duì)文冠果土壤微生物的影響有減弱的趨勢(shì)，主要是由于重金屬元素在土壤中的活性或有效性會(huì)隨其存在的時(shí)間發(fā)生變化，交換態(tài)鎘會(huì)隨時(shí)間的延續(xù)而逐漸減小[11]。Ipsilantis等通過盆栽試驗(yàn)對(duì)高濃度鉻污染下芥菜根際微生物群落進(jìn)行研究，4周后，土壤中鉻的有效態(tài)明顯降低，微生物的多樣性提高，可能是由于重金屬使優(yōu)勢(shì)種的優(yōu)勢(shì)度降低，從而消除了優(yōu)勢(shì)種對(duì)其他物種的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用，使微生物的多樣性有所提高[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)的鎘濃度為100 mg/kg時(shí)微生物豐富度、均勻度最高，而鎘濃度為10 mg/kg時(shí)微生物豐富度、均勻度最低這一結(jié)論與之相似。另外，段學(xué)軍等采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，探討重金屬鎘污染條件下稻田土壤微生物種群的基因多樣性，證明低濃度鎘對(duì)某些微生物類群具有一定的刺激作用，個(gè)別種群對(duì)鎘脅迫較為敏感，種群數(shù)量大大降低[13]。

環(huán)境微生物研究中，Biolog Eco微平板由于操作簡單得到廣泛應(yīng)用，且這種方法能夠獲得豐富的數(shù)據(jù)，從而能直觀反映微生物種群的整體活性。彭芳芳等利用Biolog Eco微平板技術(shù)探索鈾污染與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，通過計(jì)算各樣品的AWCD、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等來指示微生物的結(jié)構(gòu)和功能變化，得到最終結(jié)論，不同濃度的鈾污染會(huì)使土壤微生物的AWCD降低37.6%～92.0%[14]。對(duì)Biolog Eco數(shù)值進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，土壤微生物群落代謝多樣性表現(xiàn)出差異的主要碳源為碳水化合物類，其次是氨基酸類以及胺類[14]。目前，關(guān)于這些大分子與微生物之間的相互調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)主要利用Biolog Eco微平板試驗(yàn)，但須要新的方法、新的思路補(bǔ)充進(jìn)來以便更深入地研究。魯順保等引用國外的MicroResp方法研究了澳大利亞3種類型森林(濕地松、南洋杉、貝殼杉)土壤微生物的功能多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤pH值對(duì)微生物利用L-丙氨酸、精氨酸、D-(+)-葡萄糖、N-乙?；?氨基葡萄糖的影響較大，這些類群的微生物主要分布在貝殼杉林地；分布在南洋杉林地的微生物對(duì)檸檬酸、L-蘋果酸和γ-酪氨酸的利用率較大，且主要是受總磷含量的影響；D-(+)-果糖、檸檬酸和L-半胱氨酸-鹽酸等受水分、總氮含量、總碳含量等的影響較大，這類微生物類群主要分布在濕地松林地[15]。MicroResp方法結(jié)合了Biolog和底物誘導(dǎo)呼吸2種方法的優(yōu)點(diǎn)，可以研究整個(gè)土壤中微生物的代謝功能，且耗費(fèi)低、研究周期短[16]，可以作為將來試驗(yàn)設(shè)計(jì)的一種參考。另一方面，為了了解鎘等重金屬污染與微生物群落結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，可以深入利用分子生物學(xué)技術(shù)研究微生物群落組成[17-18]。微生物代謝周期較短，從遺傳學(xué)或進(jìn)化學(xué)角度考慮，微生物群落結(jié)構(gòu)變化過程是一個(gè)優(yōu)勝劣汰的過程，鎘添加過程作為外界刺激會(huì)造成微生物遺傳信息的變化，更深一步，可以考慮從基因、蛋白質(zhì)組學(xué)或基因組學(xué)角度來解釋這種變化發(fā)生的根本原因[19]。

本研究利用主成分分析法研究了鎘添加條件下微生物對(duì)碳源利用的變化，可以從側(cè)面反映微生物群落變化和微生物活性變化，例如，在第1生長期內(nèi)，100 mg/kg鎘促進(jìn)了以D-纖維二糖、α-丁酮酸、甘氨酰-L-谷氨酸、2-羥基苯甲酸、苯乙胺等為營養(yǎng)的微生物的生存，而抑制了以衣康酸和糖苷為碳源的微生物的存活。從圖1和表2來看，鎘添加對(duì)微生物活性的影響在第2生長周期表現(xiàn)的最明顯，土壤微生物活性升高，多樣性降低，利用碳水化合物的土壤微生物種群降低，能利用多聚物的微生物種群增加。這很可能是重金屬鎘的選擇性所致，利用碳水化合物的微生物對(duì)鎘敏感，在鎘的作用下種群數(shù)降低；能利用衣康酸、肝糖的微生物對(duì)重金屬鎘有耐受性，種群數(shù)升高。Roane等通過DNA分析，檢測(cè)鎘污染及無污染土壤中的微生物組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘污染的土壤中可培養(yǎng)的微生物數(shù)量減少，但能分離出抗性微生物[20]。鎘耐性微生物成為優(yōu)勢(shì)種，鎘敏感微生物種群降低，因此文冠果第2周期應(yīng)該是對(duì)鎘添加最敏感的時(shí)期，在今后研究鎘對(duì)文冠果土壤微生物影響時(shí)應(yīng)格外關(guān)注。

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