玻璃體蛋白質(zhì)組學(xué)在眼部疾病研究中的應(yīng)用

潘 麟 ，吳 爽 ，李 聰 ，李亞男 ，蔣 靜，周占宇

(1. 大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院，遼寧 大連 116011；2.青島市市立醫(yī)院 眼科中心,山東 青島 266000)

1 玻璃體中的蛋白質(zhì)

在玻璃體中存在幾種低分子量溶質(zhì)，包括無機鹽、葡萄糖、乳酸鹽、抗壞血酸鹽、溶解的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的平均總濃度在健康人玻璃體中為1200 μg/mL，據(jù)報道玻璃體中最普遍存在的是白蛋白和免疫球蛋白(約占蛋白質(zhì)的約80%)[1]。

玻璃體中蛋白質(zhì)組成對眼睛的健康和功能至關(guān)重要，其內(nèi)容物的變化與眼部疾病有著極其重要的關(guān)系。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)玻璃體中存在豐富的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)如晶狀體蛋白和代謝中間體，而前者被提出可能是某些視網(wǎng)膜疾病的生物標(biāo)志物[2]。在最近的一項研究中，Murthy等[3]確定了1205個蛋白質(zhì)，其中682個尚未被描述過。按照分子功能分類將蛋白質(zhì)分為：27%具有催化活性，10%具有結(jié)構(gòu)活性，10%具有結(jié)合活性，4%具有細(xì)胞活性和4%具有轉(zhuǎn)運蛋白活性。生物過程的進一步分類指出28%的蛋白質(zhì)參與新陳代謝，20%存在細(xì)胞傳遞中，13%參與細(xì)胞生長。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在眼部疾病研究中的應(yīng)用

2.1 糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)

DR是糖尿病最常見并發(fā)癥之一，也是成年人致盲的主要原因之一。病史長達20年的糖尿病患者中幾乎所有1型糖尿病患者、80%需要胰島素治療的2型糖尿病患者和50%不需要胰島素治療的2型糖尿病患者都具有一定程度的DR[4]?；谂R床研究發(fā)現(xiàn)，DR分為輕度、中度、重度非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy, NPDR)和增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)[5]。PDR是嚴(yán)重威脅視力的階段，其特征在于視網(wǎng)膜新生血管的生成。DR后的血管滲漏可能導(dǎo)致糖尿病性黃斑水腫，如果不治療，會是一種威脅視力的并發(fā)癥[5]。糖尿病性黃斑水腫可能發(fā)生在DR的任何階段，但主要發(fā)生在疾病的晚期階段[4]。

2.1.1 非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR)

現(xiàn)已使用各種材料(包括淚液，房水和玻璃體)研究了NPDR的蛋白質(zhì)組。Kim等[6]對NPDR患者和健康志愿者進行了關(guān)于淚液的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，沒有視網(wǎng)膜病變和NPDR的糖尿病患者中β-2微球蛋白上調(diào)，脂質(zhì)運載蛋白-1和熱休克蛋白27下調(diào)。 NPDR患者的倍數(shù)變化明顯。Chiang等[7]發(fā)現(xiàn)DR患者房水樣本中血清轉(zhuǎn)鐵蛋白和載脂蛋白A-I水平升高，而podocan蛋白水平降低。Kim等[8]將PDR和NPDR患者的玻璃體樣品，與黃斑裂孔患者的玻璃體樣品進行了比較，PDR與黃斑裂孔和NPDR與黃斑裂孔患者樣本相比，甲狀腺素結(jié)合球蛋白、卡列司他、肝細(xì)胞生長因子激活劑、血管性血友病因子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶均增加。研究還發(fā)現(xiàn)，γ-谷氨酰水解酶被發(fā)現(xiàn)在PDR中與黃斑裂孔患者樣本相比增加，但在NPDR降低。進行血漿樣品分析，發(fā)現(xiàn)PDR與黃斑裂孔患者無差異。然而，與黃斑裂孔的患者相比，NPDR患者的血漿中甲狀腺素結(jié)合球蛋白增加。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與對照組和沒有視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者相比，NPDR中血漿甲狀腺素結(jié)合球蛋白顯著增加。

2.1.2 增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)

Loukovaara等[9]從PDR和NPDR患者收集玻璃體樣品總量138個。通過將PDR患者的玻璃體樣品與NPDR患者的玻璃體樣品進行比較，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖分子和角膜蛋白的上調(diào)與PDR的早期無關(guān)。作者假設(shè)，它們可能介導(dǎo)由PDR引起的炎癥反應(yīng)中趨化因子的聚集。作者還發(fā)現(xiàn)了涉及氧化應(yīng)激和活性氧的蛋白質(zhì)的上調(diào)，包括過氧氧化還原酶2、過氧化物還原酶6、反應(yīng)物種調(diào)節(jié)劑1和鄰苯二酚1,2-雙加氧酶蛋白。此外，PDR樣品中上調(diào)了缺氧上調(diào)蛋白-1和一氧化氮合成酶。

在PDR患者的玻璃體樣品中，Wang等[2]鑒定了血管生成素相關(guān)蛋白6和雌激素受體α的上調(diào)，其參與了PDR的新生血管生成和血管通透性增加。Gao等[10]通過比較PDR患者與無視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者和非糖尿病患者的玻璃體樣本，發(fā)現(xiàn)在PDR患者中血管緊張素原上調(diào)。與沒有視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者相比，PDR降低的蛋白質(zhì)包括神經(jīng)絲氨酸蛋白酶抑制劑、間接受體類視黃醇結(jié)合蛋白、細(xì)胞外超氧化物歧化酶、光感受器基質(zhì)蛋白多糖2和鈣調(diào)蛋白1。

蛋白質(zhì)組學(xué)研究通常不關(guān)注DR的糖尿病類型。然而Simó等[11]將1型糖尿病患者的PDR玻璃體樣品，與來自黃斑裂孔患者的玻璃體樣品進行了比較，發(fā)現(xiàn)PDR患者的玻璃體中載脂蛋白A-I和載脂蛋白H水平升高。

Gao等[12]研究比較了PDR患者、無視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者和非糖尿病患者的玻璃體樣品的蛋白質(zhì)組。研究顯示與非糖尿病患者相比，PDR患者和沒有視網(wǎng)膜病變的糖尿病患者的玻璃體樣品中玻璃體碳酸酐酶I顯著上調(diào)。隨后通過將純化的人碳酸酐酶I注射到大鼠玻璃體中，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管通透性增加。碳酸酐酶I對視網(wǎng)膜血管通透性的影響通過共同注射乙酰唑胺或甲草唑胺而被廣泛抑制，兩者都抑制碳酸酐酶I。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將碳酸酐酶I鑒定為在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中引起視網(wǎng)膜血管通透性增加的蛋白質(zhì)。然而，碳酸酐酶抑制劑I用于治療PDR的潛力仍有待評估。

2.2 糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema,DME)

DME是糖尿病視網(wǎng)膜病變患者視力喪失的主要原因[13]，可能需要進行幾次玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物和密切隨訪，才能獲得較穩(wěn)定的預(yù)后視力[14]。因此，用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定潛在的藥物靶點是非常重要的。Hernándezet等[15]研究了與DME有關(guān)的玻璃體蛋白質(zhì)組變化。研究人員鑒定出與患有PDR和黃斑裂孔的患者相比，DME患者的4種玻璃體蛋白質(zhì)有顯著不同：玻璃體血紅蛋白在DME中顯著上調(diào)，β-晶狀體蛋白S、聚集蛋白和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白顯著下調(diào)。該研究還通過將PDR患者的玻璃體樣品與患有黃斑裂孔的玻璃體樣品進行比較，鑒定了與PDR相關(guān)的蛋白質(zhì)。在PDR中顯著增加的蛋白質(zhì)包括載脂蛋白H、凝溶膠蛋白和維生素D結(jié)合蛋白。 PDR中含量較低的蛋白質(zhì)包括互補離體類視黃醇結(jié)合蛋白，金屬蛋白酶抑制劑2和前列腺素-H2d-異構(gòu)酶。

Cehofski等[16]分析來自同時患有NPDR和DME患者的玻璃體與視網(wǎng)膜脫離患者的玻璃體樣本比較，前者玻璃體中顯著增加的蛋白質(zhì)包括α1-B-糖蛋白、補體成分C3、纖維蛋白原γ鏈和維甲酰胺D-結(jié)合蛋白。補體成分C3比對照組上調(diào)52倍。在DR發(fā)生發(fā)展過程中很少關(guān)注到補體的激活[17]，但是蛋白質(zhì)組學(xué)研究清楚地表明補體激活在DR的發(fā)病機制中具有重要作用。

2.3 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)

PVR是孔源性視網(wǎng)膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment,RRD)發(fā)生后的主要并發(fā)癥。PVR可以被設(shè)想為傷口愈合過程中的失敗產(chǎn)物，在損傷修復(fù)過程中，視網(wǎng)膜和玻璃體的細(xì)胞發(fā)生增生、遷移，形成增殖膜附著于視網(wǎng)膜并產(chǎn)生牽拉作用導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離，其中收縮性畸形與視力預(yù)后有關(guān)[18]。Shitama等[19]是第一個使用蛋白組學(xué)的方法來研究這類疾病的，據(jù)報道一些蛋白質(zhì)在NPDR和PDR的表達中是下調(diào)的，但更顯著的是在RRD和PVR中唯一表達了組織蛋白酶D，因此被提出作為這些疾病的生物標(biāo)志物。組織蛋白酶D是一種蛋白質(zhì)，在蛋白質(zhì)降解和視紫紅質(zhì)蛋白水解作用中起重要作用[20]，因此在視網(wǎng)膜發(fā)生的病理學(xué)過程中起重要作用。Chen等[21]報道補體C4b和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白在PVR樣本中過表達，提出了這些蛋白質(zhì)水平升高與疾病之間的聯(lián)系。Yu等[22-24]是通過玻璃體蛋白質(zhì)組學(xué)對PVR研究最廣泛的組織，他們通過一系列實驗來研究這類疾病。在第1項研究中他們報道了PVR玻璃體樣品(特別是涉及糖酵解的酶)中未檢出變化顯著的蛋白質(zhì)。在玻璃體和相應(yīng)的血清樣品中特異性檢測到激肽原1，被建議為PVR的候選生物標(biāo)志物[22]。在第2項研究中，將炎癥作為PVR中涉及的重要環(huán)節(jié)，其中補體和凝血級聯(lián)代表必不可少的途徑。作者提出p53和轉(zhuǎn)錄因子E2F1作為PVR成功治療RRD的新靶點[23]。最后，作者已經(jīng)確認(rèn)了在PVR患者的玻璃體和血清樣品中特異性檢測到胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6和激肽原1，提出它們作為該疾病的候選血清生物標(biāo)志物，以及將可能的激肽原和激肽釋放酶作為PVR治療中有效的藥物靶點[24]。

2.4 年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)

AMD是全球老年人失明的主要原因[25]。AMD可以進一步細(xì)分為干性AMD和新生血管性AMD(也稱為濕性AMD)。干性AMD的早期階段的特征在于玻璃膜疣的存在，其是沉積于RPE脈絡(luò)膜界面處的玻璃膜疣[26-27]。黃斑區(qū)玻璃膜疣廣泛存在的干性AMD患者是可以發(fā)展為新生血管性AMD的主要風(fēng)險[28]。如果不治療，新生血管性AMD通常會導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失[29]。

2.4.1 干性年齡相關(guān)性黃斑變性(dry age-related macular degeneration)

Crabb等[30]研究了18只正常眼和5只AMD患眼。分離玻璃膜疣發(fā)現(xiàn)組織金屬蛋白酶抑制劑3、聚集蛋白、玻連蛋白和血清白蛋白似乎在沒有AMD患者的玻璃膜疣中很常見，而AMD患者的玻璃膜疣中更頻繁地鑒定出晶狀體蛋白。這些晶狀體蛋白包括α-晶狀蛋白B、β-晶狀蛋白B1、β-晶狀蛋白A3、β-晶狀蛋白A4、β-晶狀蛋白B2和β晶狀蛋白S。此外，研究發(fā)現(xiàn)，通過Western印跡鑒定的羧乙基吡咯免疫反應(yīng)性在AMD患者的玻璃膜疣中比在正常供體眼中更頻繁，表明氧化修飾蛋白在AMD的發(fā)病機制中具有關(guān)鍵作用。

2.4.2 新生血管性年齡相關(guān)性黃斑變性(neovascular age-related macular degeneration)

Koss等[31]分析了來自具有初始治療新生血管性AMD患者的73個玻璃體樣品，與特發(fā)性玻璃體混濁患者的15個玻璃體樣品進行了比較。新生血管性AMD中大部分顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)是血漿蛋白。該研究確定了視黃醇結(jié)合蛋白3、谷胱甘肽過氧化物酶3在新生血管性AMD患者的玻璃體樣品中的上調(diào)，這被認(rèn)為表明新生血管性AMD的氧化應(yīng)激。Nobl等[32]分析了來自新生血管性AMD患者的108個玻璃體樣品，與特發(fā)性玻璃體混濁患者的24個玻璃體樣品進行了比較。在新生血管性AMD患者的玻璃體樣品中，研究人員確定了叢生蛋白、色素上皮細(xì)胞衍生因子和前列腺素H2-D異構(gòu)酶的上調(diào)，而在新生血管性AMD中發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被下調(diào)。Yuan等[33]研究了不同階段AMD患者的脈絡(luò)膜/Bruch膜復(fù)合物的蛋白質(zhì)組學(xué)變化。在與新生血管性AMD患者的脈絡(luò)膜/ Bruch膜復(fù)合物中，研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞α-防御素1-3、玻連蛋白、膠原α-1鏈、纖維蛋白原β鏈、補體C3和成神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)蛋白AHNAK的水平升高。此外，與干性AMD患者相比，膜聯(lián)蛋白A4和補體C9在新生血管性AMD患者的Bruch膜/脈絡(luò)膜復(fù)合物中更豐富。蛋白質(zhì)組學(xué)研究支持補體激活在AMD發(fā)病機制中具有重要作用的假說。在目前階段，補體抑制劑正在測試用于治療AMD[17]。

3 展 望

玻璃體蛋白質(zhì)組學(xué)方法已經(jīng)將一些蛋白質(zhì)作為眼部疾病治療的潛在靶點，為識別具有治療價值的新生物標(biāo)志物提供重要的依據(jù)。從以往研究看只有有限數(shù)量的研究應(yīng)用定量技術(shù)，然而這種方法應(yīng)該包含更多的和更準(zhǔn)確的定量設(shè)置且不應(yīng)該停止于鑒定蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，還應(yīng)包括生物標(biāo)志物相互作用的蛋白質(zhì)伴侶和蛋白途徑的研究，關(guān)注其功能特征與疾病的病理生理過程、診斷和治療的聯(lián)系。

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