PCR探針熔解曲線法在對肺結(jié)核患者進行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用效果

常鳳霞

（青海省第四人民醫(yī)院檢驗科，青海 西寧 810000）

耐多藥結(jié)核病是一種對利福平及異煙肼同時具有耐藥性的結(jié)核病。此病屬于結(jié)核病治療中的重點及難點[1]。對耐多藥結(jié)核病患者的病情及時進行診斷，并動態(tài)地監(jiān)測其結(jié)核分枝桿菌的耐藥性，是為其制定有效的抗結(jié)核化療方案的關(guān)鍵[2]。目前，臨床上對耐多藥結(jié)核病患者結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進行監(jiān)測的主要方法是進行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗。但是，進行結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗較為費時，且存在標準化困難等缺點[2]。結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測具有用時短、可有效縮短臨床用藥指導(dǎo)的時間等優(yōu)勢[3]。本次研究主要探討PCR探針熔解曲線法在對肺結(jié)核患者進行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對象為2018年1月至2018年3月期間在青海省第四人民醫(yī)院門診或住院部接受治療20例肺結(jié)核患者。

1.2 研究方法

使用PCR探針熔解曲線法對這20例患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥性進行耐藥基因檢測，方法是：1）采集患者3～5 mL的痰液作為檢測標本。2）對檢測標本進行痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、鑒別及藥敏試驗，然后從中分離出20株結(jié)核分枝桿菌。另取30株野生型結(jié)核分枝桿菌（H37Rv標準菌株，由國家結(jié)核病研究所提供）。3）對這50株結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥性進行耐藥基因檢測，方法是：⑴本次研究使用的試劑與儀器有PCR試劑[由生工生物工程（上海）有限公司生產(chǎn)]，結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥突變檢測試劑盒（由廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)），PCR儀（由德國羅氏公司生產(chǎn)）。⑵對這50株待檢結(jié)核分枝桿菌的菌株進行復(fù)活、接種及滅活，然后采用煮沸法提取菌株中的基因組DNA，并對其進行加樣。⑶分別設(shè)立陰性DNA5 td和陽性對照品DNA5 td。對這50株菌株進行擴增后，使用PCR探針熔解曲線法檢測其對利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的基因突變情況。獲取這50株菌株對上述四種抗結(jié)核藥物的耐藥情況。其中，使用利福平進行檢測時菌株復(fù)合群rpoB基因在27個氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)存在的突變的情況；使用異煙肼進行檢測時菌株ahpC啟動子區(qū)、inhA94密碼子區(qū)及inhA啟動子區(qū)、katG315密碼子區(qū)內(nèi)存在突變的情況；使用乙胺丁醇進行檢測時菌株在embB306、embB497、embB368、embB378、embB 380及embB406位密碼子存在突變的情況；使用鏈霉素進行檢測時菌株在rpsL基因43位密碼子、基因88位密碼子、TTS基因513～517位點及TTS基因905～908位點存在突變的情況。

1.3 觀察指標

以藥敏試驗的結(jié)果為金標準，觀察這20例患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測結(jié)果與利福平、異煙肼、乙胺丁醇和鏈霉素耐藥表型的一致性。

2 結(jié)果

這20例患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌進行耐藥基因檢測的結(jié)果與利福平、異煙肼、乙胺丁醇及鏈霉素的耐藥表型的一致性分別為：利福平為98%（49/50）、異煙肼為96%（48/50）、乙胺丁醇為62%（31/50）、鏈霉素為76%（38/50）。這些患者的結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測結(jié)果與利福平、異煙肼耐藥表型的一致性較高，其結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測結(jié)果與乙胺丁醇、鏈霉素耐藥表型的一致性較低。

3 討論

相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，引起結(jié)核分枝桿菌發(fā)生耐藥的分子機制與其存在基因突變有關(guān)。結(jié)核分枝桿菌發(fā)生不同的基因突變，會導(dǎo)致其對不同藥物產(chǎn)生耐受性[2，4]。對耐多藥肺結(jié)核患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌進行耐藥基因檢測具有以下優(yōu)點：1）可快速地了解患者體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的位點是否發(fā)生突變，有利于對患者的用藥種類進行篩選。2）可在對患者進行動態(tài)的藥學(xué)監(jiān)測，及時了解其結(jié)核分枝桿菌菌株的耐藥信息、耐藥基因突變位點的變化，有利于準確地找到其體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌菌株產(chǎn)生耐藥的原因，便于有針對性地為其調(diào)整治療方案。3）可有效地阻斷患者耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播途徑，有助于控制其病情的進展[5]。有研究表明，PCR技術(shù)可以把擴增與檢測合二為一，可實時進行擴增及檢測，能夠在同一時間檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的多個相關(guān)基因突變情況，具有高效、便捷等優(yōu)點，尤其適用于臨床上對大批量基因突變的結(jié)核分枝桿菌進行篩查[3，5]。本次研究的結(jié)果顯示，這些患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測結(jié)果與利福平、異煙肼耐藥表型的一致性較高，其體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因檢測結(jié)果與乙胺丁醇、鏈霉素耐藥表型的一致性較低。此研究結(jié)果與胡春梅等[5]的研究結(jié)果相符。

綜上所述，PCR探針熔解曲線法在對肺結(jié)核患者進行結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測中的應(yīng)用效果顯著，可迅速地篩查出患者體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌對利福平等常用一線抗結(jié)核藥的耐藥情況。