氟康唑清除hk-2細(xì)胞霉菌污染的研究

王議鶴 王勤章 吳 雙 褚 浩 錢 成 徐 浩 錢 彪

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000）

細(xì)胞培養(yǎng)中的污染分為兩類，化學(xué)污染和生物污染。細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染[1]。細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。本研究針對(duì)hk-2細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)霉菌污染時(shí)，對(duì)比不同濃度氟康唑處理污染的效果及細(xì)胞狀態(tài)，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞污染情況

在近期用細(xì)胞時(shí)，出現(xiàn)了細(xì)胞污染現(xiàn)象。倒置顯微鏡高倍鏡可觀察到培養(yǎng)液中有黑色絲團(tuán)狀物夾雜在細(xì)胞中生長(zhǎng)，有的看似有根，其上部的黑色絲團(tuán)狀物可隨培養(yǎng)液的晃動(dòng)而晃動(dòng)。但培養(yǎng)液澄清，未發(fā)生渾濁，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢[2，3]。

1.2 方法

（1）培養(yǎng)方法

在無菌條件下將受污染的細(xì)胞培養(yǎng)液100 p。涂布于PDA平板，300 C倒置培養(yǎng)72 h，觀察其菌落形態(tài)。

（2）污染的去除

吸棄受污染的舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗培養(yǎng)瓶?jī)杀椋?0%及20%濃度氟康唑進(jìn)行清除，1次/d，持續(xù)10 d，同時(shí)每天鏡下仔細(xì)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

2.1 污染類型的初步鑒別結(jié)果

72 h后，平板上生長(zhǎng)出直徑約2～3 mm表面濕潤(rùn)、粘稠且隆起的圓形乳白色菌落，懷疑為酵母菌。用接種環(huán)取少量疑似為酵母菌的菌體，置于載玻片中英的無菌生理鹽水中，加蓋玻片。在高倍鏡下觀察，多數(shù)為5～10 pm的卵圓形單細(xì)胞，部分有出芽現(xiàn)象。

2.2 藥物處理結(jié)果細(xì)胞

經(jīng)1次/d的沖洗、換液、不同濃度氟康唑處理后，污染得到明顯的控制，鏡下觀察黑色絲團(tuán)狀物逐日減少，細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)尚可，未發(fā)現(xiàn)有異?，F(xiàn)象。加藥過程中可正常傳代，持續(xù)10 d后，鏡下已無真菌生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，可用于試驗(yàn)，與正常未受污染的細(xì)胞無明顯差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 污染類型

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種，分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染[4]。其中，細(xì)菌方面，細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌，葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)，在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，培養(yǎng)液一般會(huì)在短時(shí)間內(nèi)變黃，有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混，稍加震蕩會(huì)有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞停止生長(zhǎng)并有中毒表現(xiàn)。在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素，能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染。真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其臨近梅雨季節(jié)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)更易污染。污染細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠[5]；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長(zhǎng)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。真菌生長(zhǎng)的比較慢，不容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)就表明細(xì)胞被污染了，也很難救活。支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間，是一種獨(dú)立生活的微生物。對(duì)熱敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變，多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察，中心有高密度的密集顆粒，橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。因國(guó)內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測(cè)，而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁，但細(xì)胞變化不顯著，隨著細(xì)胞的培養(yǎng)會(huì)慢慢死亡。DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合，使得支原體的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。

3.2 污染處理

污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵，預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵之一。危機(jī)意識(shí)要貫徹實(shí)驗(yàn)的始終，否則不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力，甚至造成無法彌補(bǔ)的損失。本次研究中，經(jīng)1次/d的沖洗、換液、不同濃度氟康唑處理后，污染得到明顯的控制，鏡下觀察黑色絲團(tuán)狀物逐日減少，細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)尚可，未發(fā)現(xiàn)有異?，F(xiàn)象。加藥過程中可正常傳代，持續(xù)10 d后，鏡下已無真菌生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，可用于試驗(yàn)，與正常未受污染的細(xì)胞無明顯差異。氟康唑又名大扶康，是一種新型三唑類抗真菌藥物，有廣譜抗真菌作用，對(duì)真菌細(xì)胞色素P-450依賴酶的抑制作用具有高度選擇性，能選擇性地抑制真菌的甾醇合成。一旦發(fā)生真菌污染且污染細(xì)胞的價(jià)值較大，可選用10%的氟康唑氯化鈉注射液加以去除，污染得到控制后還應(yīng)在不加藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否已被消除[5]。實(shí)驗(yàn)表明，氟康唑能有效的抑制細(xì)胞培養(yǎng)基中真菌的生長(zhǎng)和繁殖，而且在有效抑菌濃度范圍內(nèi)氟康唑?qū)?xì)胞無明顯毒性，可應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)，去除細(xì)胞培養(yǎng)過程中真菌污染。

污染重在預(yù)防，預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的最好辦法，能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手：（1）從操作者做起操作者責(zé)任心要強(qiáng)，要細(xì)心穩(wěn)重，操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5 min，按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門，坐下來盡量少走動(dòng)。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi)，更不能隨便使用，以免造成大批污染。操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。操作時(shí)要常更換吸管，切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面。（2）從物品、用品消毒滅菌著手細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì)，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。（3）防止細(xì)胞交叉污染。在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。所有細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。

綜上所述，采用10%及20%濃度氟康唑進(jìn)行清除，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，可用于試驗(yàn)，與正常未受污染的細(xì)胞無明顯差異，10%濃度氟康唑既能滅菌又不對(duì)細(xì)胞造成影響。

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