低強(qiáng)度脈沖超聲對(duì)兔橈骨骨折愈合及小窩蛋白-1基因表達(dá)的影響

李　蘊(yùn)　劉邦忠　劉光華　顧文欽　肖　峰　吳一鳴　高正東　鐘宗燁

(1復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科　上?！?00032;2上海市第七人民醫(yī)院病理科　上海　200137;3 上海市徐匯區(qū)楓林街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心放射科　上?！?00030)

骨科康復(fù)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)在于促進(jìn)骨折修復(fù),縮短愈合時(shí)間,促使已經(jīng)發(fā)生的延遲愈合和不愈合重新愈合。物理因子治療被視為重要的干預(yù)手段之一。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了低強(qiáng)度脈沖超聲(low-intensity pulsed ultrasound,LIPUS)治療骨折的有效性。LIPUS治療骨折的最佳參數(shù)為:超聲頻率1.5 MHz,強(qiáng)度30 mW/cm2,占空比20%,脈沖頻率1 kHz,每日1次,每次20 min。美國(guó)FDA分別于1994年及2000年批準(zhǔn)將其用于治療新鮮骨折、骨折延遲愈合及骨不連[1]。

LIPUS促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制尚不清楚。 骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,涉及到多種細(xì)胞及信號(hào)分子的改變。小窩蛋白-1(caveolin-1)是細(xì)胞膜表面特殊膜結(jié)構(gòu)小窩(caveolae)的重要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)之一,它可通過(guò)與信號(hào)分子的結(jié)合調(diào)節(jié)相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[2]。骨折后早期小窩蛋白-1的表達(dá)增高[3],但其在LIPUS治療骨折過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律還未被證實(shí)。本研究旨在通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)檢測(cè)明確LIPUS對(duì)長(zhǎng)管狀骨骨折愈合的影響,并檢測(cè)經(jīng)LIPUS干預(yù)后骨折部位小窩蛋白-1的定位、表達(dá)及軟骨和骨特異基因的表達(dá),探討小窩蛋白-1在LIPUS治療骨折過(guò)程中的作用,從而為闡明LIPUS促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制提供依據(jù)。

材 料 和 方 法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性新西蘭白兔24只,3月齡,體重2.0～2.5 kg,普通級(jí),購(gòu)自上海生旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水,室溫控制在(20±2)℃,濕度60%,12 h/12 h間隔照明。

儀器設(shè)備低能量骨折愈合儀(日本伊藤超短波株式會(huì)社),數(shù)字化拍片系統(tǒng)(日本島津制作所),組織切片機(jī)(德國(guó)Leica公司),全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理系統(tǒng)和全自動(dòng)免疫組化染色系統(tǒng)(丹麥Dako公司),光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯株式會(huì)社),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司)。

主要試劑4%多聚甲醛溶液(武漢谷歌生物科技有限公司),小窩蛋白-1小鼠單克隆抗體(美國(guó) BD公司),二抗檢測(cè)系統(tǒng)(丹麥Dako公司),Trizol試劑(美國(guó)Sigma公司),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒(日本TAKARA公司)。

動(dòng)物模型的建立選取體重相近的健康雄性新西蘭白兔24只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈麻醉,雙側(cè)術(shù)野處剪毛,75%酒精、活力碘消毒,取雙前肢外側(cè)切口,分離周?chē)∪饧把?暴露橈骨中段,注意保護(hù)橈動(dòng)、靜脈,切開(kāi)并剝離骨膜,使用骨鋸造成橈骨中下1/3處寬為3 mm的橫行骨缺損,深達(dá)髓腔的2/3。止血、清創(chuàng),不予固定,逐層縫合切口。在無(wú)菌條件下進(jìn)行手術(shù),雙側(cè)實(shí)驗(yàn)方法相同。術(shù)后連續(xù)3天肌肉注射40萬(wàn)單位青霉素鈉,每日1次。術(shù)后所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分籠飼養(yǎng),自由活動(dòng)、進(jìn)食。

LIPUS干預(yù)造模后第2天開(kāi)始,對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右側(cè)骨折處備皮并行LIPUS刺激。于超聲探頭表面均勻涂抹專(zhuān)用耦合劑,彈性綁帶固定在右前肢骨折處后開(kāi)啟開(kāi)關(guān),強(qiáng)度為30 mW/cm2,頻率為1.5 MHz,占空比為20%,重復(fù)頻率為1 KHz,每天1次,每次治療20 min。左側(cè)作為對(duì)照,同時(shí)行切斷電源的假刺激。

動(dòng)物處理每組動(dòng)物分別在超聲干預(yù)的第7、14、21、28天于治療結(jié)束后耳緣靜脈給予3%戊巴比妥鈉(0.6 mL/kg)鎮(zhèn)定,進(jìn)行X線攝片,隨即心內(nèi)注射空氣處死,在無(wú)菌狀態(tài)下截取雙側(cè)橈骨骨痂組織,用DEPC水處理過(guò)的生理鹽水徹底沖洗后縱行劈開(kāi)平均分成兩部分:一半組織迅速置于無(wú)酶凍存管內(nèi)用液氮速凍,隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存;另一半組織置入4%多聚甲醛溶液(pH=7.4)中。

X線攝片將麻醉鎮(zhèn)靜的新西蘭白兔側(cè)臥位擺放于數(shù)字化拍片系統(tǒng)檢查床上,拍攝雙前肢正位片。攝片工作由指定放射科技師完成,攝片條件:管電壓56 kV,管電流400 mA,曝光時(shí)間110 ms,球管距動(dòng)物的距離110 cm。所有入組動(dòng)物攝片結(jié)束后,由3位對(duì)分組情況不知情的實(shí)驗(yàn)人員統(tǒng)一閱片,并行X線評(píng)分。X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]:骨折未愈合記為0分,有明顯的骨痂形成但骨缺損尚未形成橋接記為1分,有明顯的骨痂形成且骨缺損部位形成可能橋接記為2分,骨折愈合記為3分。所得圖像在萬(wàn)達(dá)區(qū)域PACS影像工作站進(jìn)行刻度校準(zhǔn),使得實(shí)物與圖像為1∶1的比例關(guān)系,應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行礦化骨痂的圈定,得到像素面積,隨后根據(jù)其與整幅圖像像素面積之比計(jì)算出實(shí)際骨痂面積。

HE染色將固定好的骨痂組織轉(zhuǎn)入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的鹽酸-多聚甲醛溶液脫鈣3～6天,每24 h更換脫鈣液。脫鈣成功后,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,組織浸蠟,縱向石蠟包埋,切片,厚度為3μm。對(duì)切片行常規(guī)脫蠟,分別移至無(wú)水乙醇和95%乙醇中各1 min,自來(lái)水沖洗后,將切片移至蘇木精染液內(nèi)靜置7～10 min。自來(lái)水沖洗后在鹽酸乙醇內(nèi)分化數(shù)秒,水洗反藍(lán),移到l%伊紅-乙醇溶液內(nèi),對(duì)比染色1 min。在95%乙醇Ⅰ、Ⅱ及無(wú)水乙醇Ⅰ、Ⅱ中分別脫水30 s,再經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ完全透明各30 s,最后在蓋玻片下以光學(xué)樹(shù)脂膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察骨折愈合的組織病理學(xué)變化。

免疫組化染色取石蠟切片用過(guò)二甲苯脫蠟3次,每次10 min;100%、90%、80%乙醇梯度水化,每次1 min,蒸餾水漂洗,置于TBST緩沖液中。將切片浸入Tris-EDTA緩沖液(pH=9.0),用全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理系統(tǒng)進(jìn)行抗原修復(fù)(95 ℃、17 min),TBST緩沖液中自然冷卻10 min。滴加工作濃度為1∶100的小窩蛋白-1一抗于切片上,室溫45 min孵育;TBST沖洗,滴加10% H2O2溶液,室溫下孵育5 min;TBST沖洗,滴加二抗,室溫下孵育20～30 min;TBST沖洗,滴加DAB溶液,鏡下觀察顯色結(jié)果,陽(yáng)性為棕褐色,待陽(yáng)性部位出現(xiàn)特異性顯色而背景無(wú)著色時(shí),用自來(lái)水沖洗終止顯色,蘇木精復(fù)染,脫水,封片。每張免疫組化切片隨機(jī)選取3個(gè)不重疊視野(×400),在光學(xué)顯微鏡下拍照,使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量積分吸光度(D),并計(jì)算平均值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)稱(chēng)取200 mg于-80 ℃冰箱保存的骨痂組織,置入研缽使用液氮均勻研磨,將組織粉末轉(zhuǎn)入預(yù)冷的無(wú)酶1.5 mL EP管內(nèi),加入1 mL Trizol,使用多樣品組織研磨機(jī)勻漿,室溫放置5 min,充分裂解。加入200μL氯仿,混勻,室溫放置3 min。4 ℃、12 000×g離心15 min。盡可能完全吸取上層水相,置于另一1.5 mL EP管中。加入0.5 mL異丙醇,顛倒,室溫靜置10 min。4 ℃、12 000×g離心10 min,棄上清,RNA沉于管底,室溫晾干5～10 min。加入50μL DEPC水溶解RNA樣品,使用超微量微孔板分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作指導(dǎo)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后以SYBR Green為熒光染料,進(jìn)行qPCR檢測(cè),每個(gè)樣品的每個(gè)基因設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。所用引物由上海啟因生物科技有限公司根據(jù)NCBI的mRNA序列設(shè)計(jì)并合成(表 1),數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。

結(jié)　　　果

X線表現(xiàn)LIPUS干預(yù)7天后,雙側(cè)骨折線較清晰,無(wú)明顯骨痂形成。第14天時(shí),雙側(cè)骨折線開(kāi)始模糊,實(shí)驗(yàn)側(cè)骨膜反應(yīng)較強(qiáng),形成的骨痂較對(duì)照側(cè)明顯,且骨缺損部位大部分被新生骨痂充填。第21天時(shí),對(duì)照側(cè)骨缺損部位有明顯的骨痂形成,但實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂含量仍顯著多于對(duì)照側(cè),骨缺損部位完全被新生骨痂充填并可能形成橋接。治療28天后,實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂面積顯著大于對(duì)照側(cè),骨皮質(zhì)連續(xù)性也基本恢復(fù),對(duì)照側(cè)尚未形成完全的骨性橋接(圖 1A)。

表 1　目的基因引物序列Tab 1　The primer sequence of target genes

A:Radiographs;B:Radiographic score;C:Mineralized callus area.vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.

圖1術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兔橈骨的影像學(xué)改變
Fig1Radiologicalchangesintheradiusofrabbitsatdifferenttimepointsafterthesurgery

X線評(píng)分LIPUS干預(yù)7天后,雙側(cè)橈骨均無(wú)明顯骨折愈合證據(jù)。第14天,實(shí)驗(yàn)側(cè)X線評(píng)分顯著高于對(duì)照側(cè)(P=0.017),第21、28天實(shí)驗(yàn)側(cè)X線評(píng)分顯著高于對(duì)照側(cè)(P均為0.005)。雙側(cè)橈骨X線評(píng)分均隨治療時(shí)間延長(zhǎng)而升高,各時(shí)間點(diǎn)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001,圖 1B)。

礦化骨痂面積術(shù)后第7天,雙側(cè)橈骨均無(wú)明顯礦化骨痂生成,自第14天起,礦化骨痂面積迅速增加,實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著大于對(duì)照側(cè)(14天:P=0.003;21天:P<0.001;28天:P=0.004)。 雙側(cè)橈骨礦化骨痂面積總體呈逐漸增加的趨勢(shì),不同時(shí)間點(diǎn)間礦化骨痂面積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.001,圖 1C)。

組織學(xué)觀察造模后第7天,對(duì)照側(cè)仍存在一定量的纖維肉芽組織,并可見(jiàn)由骨折斷端間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的幼稚的軟骨細(xì)胞大量增殖;實(shí)驗(yàn)側(cè)軟骨細(xì)胞持續(xù)增殖并逐漸向肥大軟骨細(xì)胞分化,出現(xiàn)大片軟骨島。治療14天后,對(duì)照側(cè)軟骨細(xì)胞持續(xù)大量增殖、分化,形成軟骨基質(zhì),少數(shù)軟骨細(xì)胞凋亡,來(lái)自骨外膜的破骨細(xì)胞侵入并溶解吸收鈣化的軟骨基質(zhì),間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞,在殘存的軟骨基質(zhì)表面成骨,開(kāi)始形成原始骨小梁;實(shí)驗(yàn)側(cè)軟骨細(xì)胞肥大、退變,軟骨基質(zhì)鈣化,骨小梁粗而長(zhǎng),可見(jiàn)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞沿骨小梁排布。第21天,對(duì)照側(cè)軟骨細(xì)胞開(kāi)始退化、凋亡,軟骨內(nèi)成骨普遍,骨小梁相互連接成網(wǎng);實(shí)驗(yàn)側(cè)大量軟骨細(xì)胞退化、死亡,破骨細(xì)胞多見(jiàn),骨小梁呈編織樣。治療28天后,對(duì)照側(cè)軟骨細(xì)胞逐漸退化,軟骨基質(zhì)鈣化明顯,骨小梁接連成片;實(shí)驗(yàn)側(cè)編織骨逐漸向板層骨過(guò)渡,骨小梁內(nèi)可見(jiàn)較多成熟的骨細(xì)胞(圖 2)。

小窩蛋白-1免疫組化染色造模后第7天,骨折部位小窩蛋白-1多定位于軟骨細(xì)胞核,實(shí)驗(yàn)側(cè)骨折部位軟骨細(xì)胞小窩蛋白-1水平明顯高于對(duì)照側(cè)(P=0.002)。14天后,雙側(cè)橈骨骨折部位小窩蛋白-1水平均有明顯增高,主要定位于肥大軟骨細(xì)胞膜及間充質(zhì)細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)側(cè)小窩蛋白-1水平顯著高于對(duì)照側(cè)(P<0.001)。第21天,伴隨軟骨細(xì)胞的退變、凋亡,軟骨細(xì)胞的小窩蛋白-1水平降低;間充質(zhì)細(xì)胞遷移至軟骨基質(zhì)表面并逐漸向成骨細(xì)胞分化,小窩蛋白-1水平隨之降低,且實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著低于對(duì)照側(cè)(P=0.001)。治療28天后,軟骨細(xì)胞逐漸退化、凋亡,小窩蛋白-1水平很低;大量間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞成骨,小窩蛋白-1水平下降,實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著低于對(duì)照側(cè)(P=0.017,圖 3)。在骨折愈合過(guò)程中,小窩蛋白-1水平呈現(xiàn)先上升后下降的規(guī)律,不同時(shí)間點(diǎn)小窩蛋白-1水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(對(duì)照側(cè):P<0.001,實(shí)驗(yàn)側(cè):P<0.001,圖 4)。

圖 2　術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兔橈骨骨折部位組織學(xué)改變(HE染色,×100)Fig 2　Histological changes in radius fracture sites of rabbits at different time points after the surgery (HE staining,×100)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖5):術(shù)后7、14天,小窩蛋白-1基因表達(dá)增加,且第7天時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著高于對(duì)照側(cè)(P=0.028);術(shù)后21、28天,小窩蛋白-1基因表達(dá)降低,實(shí)驗(yàn)側(cè)表達(dá)水平反而低于對(duì)照側(cè),與21天時(shí)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在骨折愈合過(guò)程中隨時(shí)間的延長(zhǎng)Col2a1基

圖3　術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兔橈骨骨折部位小窩蛋白-1的免疫組化染色(HE染色,×200)Fig 3　Immunohistochemistry of caveolin-1 in radius fracture sites of rabbits at different time points after the surgery (HE staining,×200)

vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.

圖4術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)兔橈骨骨折部位小窩蛋白-1水平
Fig4Caveolin-1levelsinradiusfracturesitesofrabbitsatdifferenttimepointsafterthesurgery

因相對(duì)表達(dá)量下降,術(shù)后7、14天實(shí)驗(yàn)側(cè)表達(dá)均顯著高于對(duì)照側(cè)(P=0.002,P=0.03);術(shù)后21、28天,實(shí)驗(yàn)側(cè)表達(dá)顯著低于對(duì)照側(cè)(P=0.025,P=0.006)。術(shù)后7、14天,Col10a1表達(dá)增加,實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著高于對(duì)照側(cè)(P均為0.01);此后表達(dá)下降,21天時(shí)實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著低于對(duì)照側(cè)(P=0.031)。術(shù)后7、14天,骨鈣蛋白基因表達(dá)增加,實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著高于對(duì)照側(cè)(P=0.001,P=0.012),第21、28天時(shí)表達(dá)下降,實(shí)驗(yàn)側(cè)顯著低于對(duì)照側(cè)(P均為0.003)。

討　　　論

促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨是LIPUS加速長(zhǎng)管狀骨骨折愈合的重要機(jī)制研究證實(shí)LIPUS加速骨痂的形成,骨痂面積顯著增加[5]。長(zhǎng)管狀骨骨折后軟骨痂以軟骨成分為主,軟骨內(nèi)成骨在其骨折修復(fù)中扮演重要角色[6]。組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)LIPUS干預(yù)使軟骨內(nèi)成骨、硬骨痂橋接等提前出現(xiàn)[7];體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)LIPUS可以促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化,促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、分化,影響軟骨基質(zhì)的形成[8-9]。本研究發(fā)現(xiàn):實(shí)驗(yàn)側(cè)礦化骨痂、骨性橋接出現(xiàn)的時(shí)間較對(duì)照側(cè)早,自第14天開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)側(cè)X線評(píng)分、礦化骨痂面積均顯著高于對(duì)照側(cè);組織學(xué)結(jié)果也表明,實(shí)驗(yàn)側(cè)骨痂組織軟骨細(xì)胞在前14天更多、更成熟,軟骨基質(zhì)鈣化、軟骨細(xì)胞凋亡以及原始骨小梁出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)較早,這與既往研究結(jié)果一致。

軟骨及骨特異基因的表達(dá)情況同樣驗(yàn)證了LIPUS的促成骨效應(yīng)。軟骨細(xì)胞的程序性分化是軟骨內(nèi)成骨的重要環(huán)節(jié)之一,是幼稚的增殖性軟骨細(xì)胞向成熟的肥大軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過(guò)程。軟骨細(xì)胞在早期分化增殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生包括Ⅱ型膠原在內(nèi)的大量基質(zhì)蛋白,而在肥大化的過(guò)程中可以分泌Ⅹ型膠原,因此Col2a1及Col10a1分別被認(rèn)為是軟骨細(xì)胞增殖及肥大的標(biāo)志基因[10]。本實(shí)驗(yàn)中軟骨特異基因的表達(dá)規(guī)律說(shuō)明:造模后形成的骨痂內(nèi),增殖性軟骨細(xì)胞數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì),軟骨細(xì)胞經(jīng)歷逐漸肥大化隨后凋亡的過(guò)程。術(shù)后第7、14天,超聲治療側(cè)骨痂內(nèi)上述兩基因的表達(dá)明顯高于對(duì)照側(cè),說(shuō)明超聲刺激促進(jìn)了骨痂內(nèi)部軟骨細(xì)胞的增殖分化進(jìn)程。第21天開(kāi)始,上述兩基因在實(shí)驗(yàn)側(cè)的表達(dá)低于對(duì)照側(cè),這可能與軟骨細(xì)胞提前分化進(jìn)入終末期并發(fā)生凋亡有關(guān)。骨鈣蛋白是由成骨細(xì)胞合成并分泌的一種非膠原骨蛋白,可以反映成骨細(xì)胞的活性,其表達(dá)隨成骨細(xì)胞的分化而增加,并隨其轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌?xì)胞而下降[11]。本研究發(fā)現(xiàn):術(shù)后第7、14天,在LIPUS刺激下成骨細(xì)胞分化程度增高;隨后,成骨細(xì)胞分泌類(lèi)骨質(zhì)并逐漸向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變,實(shí)驗(yàn)側(cè)的成熟骨細(xì)胞較對(duì)照側(cè)多,因此可以解釋第21、28天實(shí)驗(yàn)側(cè)骨鈣蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照側(cè)。已知膜內(nèi)成骨稍快于軟骨內(nèi)成骨并共同參與骨折部位原始骨痂的形成,本研究中qPCR實(shí)驗(yàn)測(cè)得的骨鈣蛋白來(lái)自參與上述兩過(guò)程的成骨細(xì)胞,這也是前2周骨鈣蛋白表達(dá)先增加后下降的原因之一。結(jié)合組織學(xué)觀察結(jié)果,可以認(rèn)為L(zhǎng)IPUS能夠促進(jìn)骨折愈合過(guò)程中成骨細(xì)胞的活性及其分化成熟。

vs.Control,(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001.The data represents at least 3 independent experiments.

圖5術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)小窩蛋白-1(A),Col2a1(B),Col10a1(C)及骨鈣蛋白(D)的mRNA相對(duì)水平
Fig5TherelativemRNAlevelofcaveolin-1(A),Col2a1(B),Col10a1(C)andosteocalcin(D)atdifferenttimepointsafterthesurgery

LIPUS通過(guò)改變小窩蛋白-1的表達(dá)促進(jìn)骨折愈合LIPUS作為一種高頻低張的機(jī)械波,可以通過(guò)機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等改變細(xì)胞的物理微環(huán)境。目前認(rèn)為L(zhǎng)IPUS可以傳播至骨痂軟組織及礦化組織形成的多孔網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部,并在這些孔隙內(nèi)產(chǎn)生流體微動(dòng),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生,施加剪應(yīng)力激活細(xì)胞膜表面的機(jī)械性刺激感受器[1]。因此,LIPUS促進(jìn)骨折愈合與機(jī)械信號(hào)的呈遞密切相關(guān)。

小窩是呈燒瓶狀的特異細(xì)胞膜內(nèi)陷微區(qū),對(duì)機(jī)械刺激敏感[12],參與包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)的眾多生物學(xué)過(guò)程。小窩蛋白是組成小窩的重要結(jié)構(gòu)蛋白,有3個(gè)亞型:小窩蛋白-1、2、3。小窩主要通過(guò)小窩蛋白-1的“腳手架”結(jié)構(gòu)域與各信號(hào)分子的催化亞基結(jié)合,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。小窩蛋白不僅定位于細(xì)胞質(zhì)膜,還存在于細(xì)胞核及多種細(xì)胞器中。

小窩蛋白-1可能參與骨折愈合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Rubin等[13]發(fā)現(xiàn)小窩蛋白-1基因敲除小鼠的骨體積及強(qiáng)度顯著增加。Tang等[3]發(fā)現(xiàn)骨折后外周血單個(gè)核細(xì)胞中小窩蛋白-1基因表達(dá)水平升高,并在骨折后第9～12天達(dá)到高峰。Baker等[14]指出間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中,小窩蛋白-1基因表達(dá)增加,阻止其進(jìn)一步分化,被視為一種負(fù)反饋機(jī)制。Hollins等[15]通過(guò)檢測(cè)小窩蛋白-1在雞胚胎軟骨形成中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)其在軟骨發(fā)育過(guò)程中表達(dá)增加,推測(cè)其可能參與軟骨細(xì)胞分化的調(diào)控。我們?cè)谇捌谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn),大鼠骨折愈合早期骨痂中軟骨細(xì)胞分布區(qū)可見(jiàn)小窩蛋白-1表達(dá)顯著,隨著軟骨細(xì)胞消失其水平下降[16]。

本研究發(fā)現(xiàn),術(shù)后第7、14天,實(shí)驗(yàn)側(cè)軟骨細(xì)胞增殖分化程度均高于對(duì)照側(cè)。造模后7天可見(jiàn)軟骨細(xì)胞小窩蛋白-1主要定位在細(xì)胞核,實(shí)驗(yàn)側(cè)表達(dá)量明顯高于對(duì)照側(cè)。已知小窩蛋白-1可通過(guò)與共定位于小窩內(nèi)的信號(hào)分子的核轉(zhuǎn)位控制細(xì)胞增殖相關(guān)基因的啟動(dòng)[2]。Sedding等[17]在體外培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn):在機(jī)械應(yīng)力增加的情況下,小窩蛋白-1可以促進(jìn)其細(xì)胞周期進(jìn)程。以上結(jié)果提示LIPUS可能通過(guò)小窩蛋白-1的核轉(zhuǎn)位促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。術(shù)后第14天,雙側(cè)骨痂小窩蛋白-1表達(dá)均有明顯增加,主要定位于肥大軟骨細(xì)胞膜,實(shí)驗(yàn)側(cè)表達(dá)量顯著高于對(duì)照側(cè)。目前已知小窩蛋白-1參與調(diào)控軟骨細(xì)胞的分化[15],說(shuō)明LIPUS可通過(guò)上調(diào)小窩蛋白-1的表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的肥大化。第21、28天,軟骨細(xì)胞退變、凋亡,間充質(zhì)細(xì)胞小窩蛋白-1蛋白質(zhì)水平在向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中降低,實(shí)驗(yàn)側(cè)明顯低于對(duì)照側(cè)。研究發(fā)現(xiàn)敲除小窩蛋白-1基因后促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[14],提示LIPUS可能通過(guò)下調(diào)小窩蛋白-1的表達(dá)促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。小窩蛋白-1 mRNA水平也呈現(xiàn)類(lèi)似的規(guī)律,但第7、28天雙側(cè)骨痂表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這可能與骨折愈合過(guò)程相互交織的特性有關(guān),即骨痂組織內(nèi)部不僅含有增殖分化的軟骨細(xì)胞,還含有向成骨細(xì)胞分化的間充質(zhì)細(xì)胞。

綜上所述,促進(jìn)軟骨內(nèi)成骨是LIPUS加速長(zhǎng)管狀骨骨折愈合的重要機(jī)制,在這個(gè)過(guò)程中小窩蛋白-1可能發(fā)揮了重要的作用:在軟骨痂形成期,LIPUS可能通過(guò)上調(diào)小窩蛋白-1的表達(dá)促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖、分化;在硬骨痂形成期,在LIPUS的作用下,小窩蛋白-1基因表達(dá)降低,間充質(zhì)細(xì)胞逐漸向成骨細(xì)胞分化并成骨。我們的后續(xù)研究將對(duì)產(chǎn)生上述效應(yīng)的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和靶基因進(jìn)行進(jìn)一步探索。

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