母乳揮發(fā)性成分固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)條件的優(yōu)化及測(cè)定

高雅慧,李子杰

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122;2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

母乳是嬰兒最天然、最安全、最理想的食物來(lái)源,被稱(chēng)為人類(lèi)的“白色血液”。對(duì)嬰兒來(lái)說(shuō),腸道菌群尚未完全形成,其腸道、呼吸道容易受到感染,母乳對(duì)于維持嬰兒的健康具有至關(guān)重要的作用[1]。同嬰幼兒配方奶粉相比,母乳喂養(yǎng)嬰兒的病死率顯著降低[24]。母乳喂養(yǎng)除了能促進(jìn)嬰兒生長(zhǎng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育外,對(duì)肥胖、高血壓、高血脂、II型糖尿病等疾病均有一定的預(yù)防作用[56]。此外,母乳中所特有的活性物質(zhì)及微生物,對(duì)于增強(qiáng)嬰兒免疫力和腸道菌群的建立起著重要作用[712]。

母乳喂養(yǎng)具有人工喂養(yǎng)無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),但相當(dāng)一部分母親由于工作或身體的原因而不能持續(xù)進(jìn)行母乳喂養(yǎng),只能選取嬰幼兒配方奶粉作為母乳的最佳替代品。然而,長(zhǎng)期喝母乳的嬰兒很難在短期內(nèi)適應(yīng)配方奶粉的風(fēng)味,因此測(cè)定母乳所特有的揮發(fā)性成分具有重要意義。近年來(lái)對(duì)母乳的研究主要集中于對(duì)母乳中某些特定營(yíng)養(yǎng)成分的研究,比如脂肪酸、核苷酸、免疫因子等活性物質(zhì)[1317],對(duì)母乳揮發(fā)性物質(zhì)的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究采用頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法(SPMEGCMS)測(cè)定母乳的揮發(fā)性物質(zhì),通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)萃取頭的選擇、萃取量、鹽效應(yīng)、萃取溫度和時(shí)間、解析時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,從而得到母乳揮發(fā)性成分SPMEGCMS檢測(cè)的較優(yōu)條件,揭示影響母乳風(fēng)味的主要揮發(fā)性成分,為母乳配方奶風(fēng)味的改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮母乳 源于產(chǎn)后6個(gè)月的28歲母親,放置于母乳保鮮袋中,于4度冰箱保存；NaCl 分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

萃取頭:100 μm PA(polyacrylate),100 μm PDMS(polydimethylsiloxane),75 μm CAR/PDMS(carboxenpolydimethylsiloxane),65 μm DVB/PDMS(divinylbenzenpolydimethylsiloxane),50/30 μm CAR/DVB/PDMS(carboxendivinylbenzenpolydimethylsiloxane)涂層的萃取頭 美國(guó)Supelco公司;三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(GCMS) TriPlus RSHTrace GC ULTRATSQ Quantum XLS 全自動(dòng)進(jìn)樣氣相色譜(三重四級(jí)桿)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 萃取頭老化方法 將使用的五種固相萃取頭設(shè)置于TriPlus上的Fiber Conditioning Station中老化至沒(méi)有雜峰,老化溫度250 ℃,老化時(shí)間30 min。

1.2.2 萃取條件 取適量的液體母乳于20 mL的螺口玻璃瓶中,加入適量的NaCl,在TriPlus的Agitator中設(shè)置適當(dāng)?shù)臏囟绕胶? min,插入固相萃取頭吸附平衡,最后于GC進(jìn)樣口解析。本實(shí)驗(yàn)中分別選用了100 μm PA,100 μm PDMS,75 μm CAR/PDMS,65 μm DVB/PDMS,50/30 μm CAR/DVB/PDMS五種萃取頭進(jìn)行實(shí)驗(yàn),母乳萃取量為4 mL,NaCl加入量為1.0 g,在45 ℃下恒溫萃取30 min,解析時(shí)間5 min,研究不同萃取頭對(duì)萃取效果的影響;根據(jù)萃取頭的優(yōu)化結(jié)果,選用DVB/PDMS,萃取溫度40 ℃,萃取30 min,解析5 min,母乳的萃取量為1、2、3、4、5、6 mL,研究萃取量對(duì)總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g NaCl固體,充分混勻至NaCl能夠溶解或飽和,萃取溫度40 ℃,萃取時(shí)間30 min,解析時(shí)間5 min,研究鹽效應(yīng)對(duì)總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,分別在40、45、50、55、60、65 ℃萃取30 min,解析5 min,研究萃取溫度對(duì)總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,在60 ℃下分別萃取10、20、30、40、50、60 min,解析5 min,研究萃取時(shí)間對(duì)總峰面積及出峰數(shù)的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,在60 ℃萃取30 min,分別解析1、3、5、7、9、11 min,研究解析時(shí)間對(duì)總峰面積及出峰數(shù)的影響。所有樣品3次平行。

1.2.3 GCMS參數(shù)條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:毛細(xì)管色譜柱(TR-WAXMS 30 m×0.25 mm×0.25 mm);升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min上升至120 ℃,再以10 ℃/min上升至240 ℃,保持8 min。載氣是高純氦氣,流速是1.0 mL/min;不分流模式,進(jìn)樣口溫度為250 ℃,傳輸線(xiàn)溫度為240 ℃[18]。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源:電子能量70 eV;離子源溫度是240 ℃;燈絲電流50 μA;質(zhì)量掃描范圍(m/z):33～450 u[18]。

1.2.4 定性定量方法 定性方法:經(jīng)過(guò)軟件檢索,同時(shí)結(jié)合NIST library的配比度,本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)相似度大于800(最大值是1000)的鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。定量方法:根據(jù)峰面積歸一化計(jì)算[18]。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取頭的優(yōu)選

不同萃取頭由于其涂層極性的不同,所能吸附的物質(zhì)種類(lèi)和極性也不同。極性涂層對(duì)酸類(lèi)和酚類(lèi)物質(zhì)等極性物質(zhì)有較好的吸附性,非極性涂層對(duì)非極性物質(zhì)具有較好的吸附效果,因而不同類(lèi)型的物質(zhì)需要選擇合適的萃取頭進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)單因素方差分析,不同的萃取頭對(duì)萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖1所示,DVB/PDMS所得到物質(zhì)的總峰面積及出峰數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PA、PDMS和CAR/PDMS,比CAR/DVB/PDMS略高?？赡艿脑蚴荄VB/PDMS萃取頭具有兩極性質(zhì)[19],對(duì)多種物質(zhì)具有好的吸附效果,因此萃取頭的選擇類(lèi)型為DVB/PDMS。

圖1 萃取頭的種類(lèi)對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction fibers on extraction efficiency

2.2 萃取量對(duì)萃取效果的影響

本實(shí)驗(yàn)所用的萃取瓶的總?cè)莘e是20 mL,母乳萃取量的多少會(huì)影響萃取揮發(fā)性物質(zhì)的總峰面積及出峰數(shù)。如果樣品量太少,萃取頭得不到充分的吸附,萃取的揮發(fā)性物質(zhì)就少;如果樣品量過(guò)多,則由于樣品擠壓沒(méi)有充分的揮發(fā)面積和萃取頭無(wú)法過(guò)量吸附,導(dǎo)致萃取的揮發(fā)性物質(zhì)在一定萃取量之后趨于平穩(wěn)或者有所下降。通過(guò)單因素方差分析,不同的樣品量對(duì)萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖2所示:萃取量的增大引起總峰面積及出峰數(shù)也隨之增大;當(dāng)萃取量達(dá)到5 mL時(shí)出現(xiàn)最大總峰面積及出峰數(shù),當(dāng)萃取量達(dá)到6 mL時(shí),總峰面積沒(méi)有明顯的上升(p>0.05)且出峰數(shù)略有下降。因此母乳較優(yōu)的萃取量為5 mL。

圖2 萃取量對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of sample volumes on extraction efficiency

2.3 鹽效應(yīng)對(duì)萃取效果的影響

為了提高萃取的靈敏度,通常通過(guò)采用鹽析手段來(lái)提高基體溶液中的極性有機(jī)化合物在吸附涂層中的吸附系數(shù)從而達(dá)到更高的吸附率,但無(wú)機(jī)鹽的過(guò)量加入會(huì)增加基質(zhì)的黏度,降低物質(zhì)的擴(kuò)散速度,產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)[20]。通過(guò)單因素方差分析,不同NaCl的添加量對(duì)萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖3所示:NaCl含量的增多引起總峰面積也相應(yīng)升高,當(dāng)NaCl含量達(dá)到1.5 g 時(shí)總峰面積及出峰數(shù)最高,之后趨于平衡,這說(shuō)明1.5 g NaCl在5 mL的樣品中使揮發(fā)性有機(jī)物達(dá)到最大逸出量,因此在5 mL的母乳中選擇1.5 g NaCl為宜。

圖3 NaCl的添加量對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Effect of additive amount of sodium chloride on extraction efficiency

2.4 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響

萃取溫度也會(huì)影響總峰面積且具有雙重影響。一方面,隨著溫度的升高,增強(qiáng)被萃取物的揮發(fā)性,進(jìn)而提高分析物在頂空中的分配,減少平衡時(shí)間,提高分析速率;另一方面,溫度過(guò)高使得萃取頭的固有涂層脫附,降低分析物在涂層與樣品中的分配系數(shù),從而減少萃取頭的吸附量,影響總峰面積。通過(guò)單因素方差分析,不同的萃取溫度對(duì)萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖4所示:伴隨著溫度的升高,總峰面積和出峰數(shù)相繼增大,當(dāng)溫度升到60 ℃時(shí),總峰面積和出峰數(shù)達(dá)到最高值隨后下降,因此較優(yōu)的萃取溫度是60 ℃。

圖4 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.5 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響

萃取時(shí)間的長(zhǎng)短跟樣品的分配系數(shù)、揮發(fā)物質(zhì)的擴(kuò)散速度、萃取頭的種類(lèi)和膜厚及其吸附能力、樣品的體積等因素有著密切的關(guān)系。結(jié)果如圖5所示:萃取時(shí)間的延長(zhǎng)引起總峰面積和出峰數(shù)快速增大(p<0.01),30 min時(shí)達(dá)到最大值,而后有所減小。這表明過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的萃取可能造成組分之間的化學(xué)反應(yīng),不僅影響萃取效果,還對(duì)萃取頭有一定的影響。此實(shí)驗(yàn)中,較優(yōu)的萃取時(shí)間為30 min。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.6 解析時(shí)間對(duì)GCMS檢測(cè)的影響

解析時(shí)間與萃取頭的膜厚、長(zhǎng)短及解析的完全程度相關(guān),萃取頭越長(zhǎng)或膜厚越厚,其解析時(shí)間一般有所增加。若解析不完全則會(huì)影響方法的靈敏度,同時(shí)也會(huì)影響下一個(gè)樣品的檢測(cè)分析。若解析時(shí)間過(guò)度則會(huì)對(duì)萃取頭有一定的損害。通過(guò)單因素方差分析,不同的解析時(shí)間對(duì)GCMS檢測(cè)具有極顯著性差異(p<0.01)。結(jié)果如圖6所示:解析時(shí)間的延長(zhǎng)引起總峰面積及出峰數(shù)繼而增大,在解析5 min之后峰面積變化不大(p>0.05),因此較優(yōu)的解析時(shí)間選擇為5 min。

圖6 解析時(shí)間對(duì)GCMS檢測(cè)的影響Fig.6 Effect of desorption duration on GCMS detection

2.7 母乳揮發(fā)性成分分析

在上面篩選出的較優(yōu)條件下對(duì)母乳揮發(fā)性成分進(jìn)行了測(cè)定,揮發(fā)性成分及相對(duì)含量見(jiàn)表1。分析得到34種揮發(fā)性成分,其中烯烴類(lèi)最多,有14種(總含量為74.97%),其中右旋萜二烯和萜品烯的含量分別占揮發(fā)性物質(zhì)總含量的47.68%和12.44%;酸類(lèi)有5種(總含量為15.54%)、相對(duì)含量較高的有癸酸(6.77%)和辛酸(5.43%);酯類(lèi)有8種(總含量為4.25%),相對(duì)含量較高的是癸酸乙酯(1.13%);芳香烴類(lèi)有4種(總含量為3.91%),相對(duì)含量較高的為二甲苯(2.53%);酮類(lèi)3種(總含量為1.33%),相對(duì)含量較高的為乙偶姻(0.8%)。由此可見(jiàn)右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要揮發(fā)性成分,酸類(lèi)、酯類(lèi)、芳香烴類(lèi)和酮類(lèi)是母乳特殊風(fēng)味的重要組成部分。

表1 母乳的揮發(fā)性成分及其相對(duì)含量Table 1 Volatile compounds and relative contents of breast milk

羊奶中含有42種揮發(fā)性物質(zhì),其中酸類(lèi)物質(zhì)最多,有14種,包括10種短鏈脂肪酸,含量較高的是己酸、辛酸和癸酸,占揮發(fā)性成分的68%,可能和羊奶特有的膻味有關(guān)[18]。除了酸類(lèi)物質(zhì)外,還含有6種酯類(lèi)物質(zhì),和羊奶特殊的香氣有關(guān)[18]。此外,揮發(fā)性物質(zhì)還包括烷烴、芳香族、醇、醛酮和雜環(huán)類(lèi)化合物,相對(duì)含量較高的有丙酮、苯甲醛等[18]。酸牛奶揮發(fā)性物質(zhì)主要有酸類(lèi)(28%)和酮類(lèi)(29%),酸類(lèi)物質(zhì)對(duì)酸牛奶的風(fēng)味強(qiáng)度影響較大,酮類(lèi)物質(zhì)賦予酸牛奶特征性的風(fēng)味,屬于酮類(lèi)物質(zhì)的乙偶姻是酸牛奶中含量最高的揮發(fā)性物質(zhì)(13.4%)[21]。

3 結(jié)論

本研究利用單因素實(shí)驗(yàn)分析了影響SPMEGC-MS檢測(cè)的6個(gè)因素,確定了母乳揮發(fā)性成分的檢測(cè)條件為DVB/PDMS萃取頭、樣品量 5 mL、添加 1.5 g NaCl、萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間30 min、解析時(shí)間5 min,在此較優(yōu)檢測(cè)條件下分析得到34種揮發(fā)性成分,其中烯烴類(lèi)14種、酸類(lèi)5種、酯類(lèi)8種、芳香烴類(lèi)4種、酮類(lèi)3種。右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要揮發(fā)性成分,本研究將為改善配方奶的風(fēng)味提供一定的理論依據(jù)。

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