三種粗糧粉體外調(diào)節(jié)腸道菌群的作用研究

曹文燕,黃蓮燕,朱紅廣,丁 立,王 靜

(北京工商大學(xué),北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048)

腸道菌群是一個(gè)龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),一個(gè)健康成人的腸道有500～1000種細(xì)菌,總數(shù)達(dá)1013～1014,是人體體細(xì)胞的10倍之多,它們編碼的基因是人體自身基因的100倍,大量研究表明，腸道菌群組成的結(jié)構(gòu)和比例與人體健康狀況存在著密切的聯(lián)系。腸道菌群失調(diào)不僅會(huì)引起腹瀉、便秘等多種胃腸道疾病[12],也會(huì)誘發(fā)肥胖、衰老、代謝綜合征、糖尿病甚至癌癥等其他疾病[34]。21世紀(jì)以來,高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)掀起了研究腸道菌群的熱潮,其可直接測序16S rRNA基因的PCR產(chǎn)物,每次分析獲得的基因序列數(shù)百萬甚至億萬計(jì),不僅通量高,而且能夠同時(shí)分析上百個(gè)不同的樣品,是分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落物種組成的重要工具[5]。

麩皮是糧食加工過程中的副產(chǎn)品,來源充足且價(jià)格低廉,麩皮中不僅富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等物質(zhì),更是一種重要的膳食纖維來源,對人體的健康起著重要作用[67]。

麩皮中的膳食纖維和生物活性物質(zhì),雖然不被機(jī)體內(nèi)源性消化酶所水解,但是可以被腸道微生物所利用,產(chǎn)生包括短鏈脂肪酸在內(nèi)的一系列代謝產(chǎn)物,通過代謝產(chǎn)物對機(jī)體健康起著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明,膳食纖維能夠有效調(diào)節(jié)腸道菌群組成,如促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌等益生菌的增殖,抑制病原菌生長、減少有毒發(fā)酵產(chǎn)物的形成[8]。麩皮中各種營養(yǎng)成分和植物化學(xué)素保持原生狀態(tài)、并存在協(xié)同增效作用,因此與攝入提純的植物化學(xué)素相比,更加有利于人體健康。本文選用了不同品種的三種谷物麩皮(小麥、黑小麥和燕麥),將其配制成粗糧粉,在體外構(gòu)建模擬發(fā)酵體系,利用16S rRNA高通量測序技術(shù)探究不同粗糧粉對腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥麩皮、燕麥麩皮 源自河北熱河有限公司;黑小麥麩皮 源自濟(jì)南渲益農(nóng)業(yè)科技有限公司;金沙河富強(qiáng)高筋小麥粉 當(dāng)?shù)爻?α淀粉酶(1 kU)、胃蛋白酶(8 kU)、胰液素 美國Sigma公司;豬膽鹽、低聚果糖、透析袋(1000 kDa) 上海源葉生物科技有限公司;胰蛋白胨、酵母浸粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;無水氯化鈣、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純,西隴化工股份有限公司;七水硫酸鎂、樹脂天青、維生素K1、氯化血紅素 分析純,麥克林公司;L半胱氨酸、吐溫80 化學(xué)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;β葡聚糖試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司;DNA提取試劑盒 美國Omega公司;DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司。

漩渦儀 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司;AL203電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司;YXQLS50A高壓滅菌鍋 上海云泰儀器儀表有限公司;THZ82A水浴恒溫振蕩器 上海江心儀器有限公司;DG250小型厭氧工作站 英國don whitley scientific公司;920 Titrando恒定pH電位滴定儀 美國奧豪斯(上海)有限公司;Freezone?真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司;CMAG HS 7磁力攪拌器 德國IKA公司;AOC20i氣相色譜 日本島津公司;ThermoNanoDrop2000紫外分光光度計(jì) 美國賽默飛公司

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麩皮與面粉的混合 分別將小麥麩、黑小麥麩、燕麥麩用超微粉碎機(jī)進(jìn)行碾磨,并過80目篩,按照15%(W/W)麩皮添加量添加到面粉中,混勻。

1.2.2 麩皮中總膳食纖維、多酚和β葡聚糖含量的測定 膳食纖維含量的測定參照:GB/T5009.882014。

β葡聚糖含量的測定方法參照MIXED-LINKAGE BETAGLUCAN試劑盒中AACC Method 3223.01方法進(jìn)行測定。

麩皮中多酚類物質(zhì)的測定參照藺艷君等[9]的方法,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示,即μg沒食子酸(GAE)/g原料表示。

1.2.3 體外模擬消化過程 稱取約12 g的混合粉,加100 mL蒸餾水用磁力攪拌器混勻后,121 ℃高壓滅菌15 min,待冷卻至常溫后再加入100 mL無菌蒸餾水;加入7 mL(20 U/mL)α淀粉酶溶液,在37 ℃恒溫水浴振蕩器中培養(yǎng)30 min,模擬口腔消化;用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH=2,加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸(含0.54 g蛋白酶),37 ℃恒溫水浴振蕩器培養(yǎng)2 h,模擬胃消化;用6 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=6.8,并加入25 mL 0.5 mol/L碳酸氫鈉(含0.11 g胰液素和0.7 g豬膽鹽),放入1 kDa的再生纖維素透析袋中,在0.1 mol/L氯化鈉溶液,37 ℃過夜透析,第2 d更換一次透析液,再透析2 h,模擬小腸消化;將透析袋中的消化乳糜低溫真空冷凍干燥后保存于20 ℃冰箱中[1011]。

1.2.4 體外模擬發(fā)酵過程

1.2.4.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制 胰蛋白胨2 g/L、酵母浸粉2 g/L、氯化鈉0.1 g/L、磷酸氫二鉀0.04 g/L、碳酸鈉2 g/L、七水硫酸鎂0.01 g/L、無水氯化鈣0.01 g/L、吐溫80 2 mL/L、氯化血紅素50 mg/L、維生素K110 μL/L、L半胱氨酸0.5 g/L、豬膽鹽0.5 g/L、樹脂天青1 mg/L[10]。配成溶液后,用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH=6.8,分裝到100 mL錐形瓶中,每個(gè)錐形瓶45 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基,經(jīng)高壓滅菌后轉(zhuǎn)移到厭氧工作站除氧24 h。

1.2.4.2 新鮮糞便的采集 于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天原位采集2女1男的糞便各30 g左右,置于厭氧箱中,整個(gè)采集過程10 min內(nèi)完成。要求所有提供糞便的志愿者身體健康,沒有胃腸病史,近半年來沒有接受過抗生素的治療。在厭氧工作站中用0.1 mol/L pH=6.8的無氧無菌磷酸鹽緩沖溶液按1∶10(w/v)稀釋混勻[12]。

1.2.4.3 發(fā)酵過程 向每個(gè)培養(yǎng)基中加入5 mL的糞便稀釋液和0.5 g(按1%(w/v)的添加量)的消化乳糜,在37 ℃厭氧條件下發(fā)酵48 h,一式三份。同時(shí)以添加1%(w/v)的低聚果糖發(fā)酵作為陽性對照,以不添加任何碳水化合物的發(fā)酵作為陰性對照。

1.2.5 16S rRNA對菌群多樣性分析

1.2.5.1 提取細(xì)菌總DNA 參照試劑盒Stool DNA kits提取發(fā)酵液中(一式三份等體積混合)總DNA,用紫外分光光度計(jì)測定OD值,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。擴(kuò)增細(xì)菌的16S區(qū)域V3～V4區(qū),擴(kuò)增引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT),在引物的5′端加上合適的Hiseq2500 PE250測序的index序列和接頭序列,完成特異性引物的設(shè)計(jì)。

1.2.5.2 PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化 以稀釋后的基因組DNA為模板,使用KAPA HiFiHotstartReadyMix PCR kit高保真酶進(jìn)行PCR[13],確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。切膠回收后,用紫外分光光度計(jì)和1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行文庫質(zhì)檢。

1.2.5.3 Illumina測序 質(zhì)檢合格后,使用Illumina Hiseq PE250進(jìn)行上機(jī)測序。測序結(jié)束后,按照相似度97%進(jìn)行聚類,得到OTU(Operational Taxonomic Units),每個(gè)OTU被認(rèn)為可以代表一個(gè)物種。

1.2.6 氣相色譜(GC)測定發(fā)酵液中短鏈脂肪酸(SCFA)

1.2.6.1 GC條件 色譜柱:SHRtx5柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);以氮?dú)庾鳛檩d氣,總流速為140 mL/min;進(jìn)樣量 1 μL,進(jìn)樣口溫度280 ℃,FID檢測器溫度300 ℃,不分流;采用程序升溫:80 ℃;3 ℃/min,150 ℃;20 ℃/min,250 ℃,2 min。

1.2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別配制一定濃度的乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)母液,按照上述色譜條件分別找出每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間。將三種母液混合后,梯度稀釋,進(jìn)樣檢測。以峰面積為縱坐標(biāo),對照品濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

乙酸回歸方程:y=1686.5x3940.4(R2=0.98)

丙酸回歸方程:y=2906.1x+2235.3(R2=0.99)

丁酸回歸方程:y=4154.4x+809.2(R2=0.99)

1.2.6.3 樣品前處理 取發(fā)酵48 h的2 mL發(fā)酵液,加0.2 mL 50% H2SO4酸化10 min,再加2 mL乙醚在冰上間歇振蕩提取30 min,后于4800 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)樣[1415]。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS v19.0軟件進(jìn)行顯著性分析,所有樣品進(jìn)行三次測定(n=3),數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 麩皮中膳食纖維、β葡聚糖和總酚成分分析

從表1可知,黑小麥麩皮總膳食纖維(TDF)最高,達(dá)53.42%,其次是小麥麩皮(41.00%),燕麥麩皮的TDF含量最低,為29.66%,這一結(jié)果與顧堯臣[16]報(bào)道的谷物麩皮中膳食纖維含量相一致。燕麥麩皮中β葡聚糖含量顯著高于其他兩種麩皮(p<0.05),達(dá)到10.70%,分別比小麥麩皮和黑小麥麩皮高出2.6和3.2倍。小麥麩皮和黑小麥麩皮的總酚含量(分別為2955.39和2786.58 μgGAE/g)顯著(p<0.05)高于燕麥麩皮(1762.28 μgGAE/g)這一結(jié)果與目前報(bào)道的麩皮總酚含量相一致[1718]。

表1 麩皮中膳食纖維、β葡聚糖和總酚含量Table 1 Total dietary fibers,βglucan and total phenolie contents of brans

2.2 稀釋曲線分析

通過高通量測序16S rRNA每個(gè)樣品產(chǎn)生了至少27266條序列,在相似度為97%的條件下,共產(chǎn)生了658個(gè)OTU。如圖1所示,Shannon曲線和稀釋曲線反映了在目前的測序深度下,每個(gè)樣品的微生物多樣性測序深度足夠。Chao1和ACE指數(shù)反映的是樣品中物種的豐富度,從表2可知,與陽性對照組相比,粗糧發(fā)酵后微生物豐度降低;三種粗糧組之間比較發(fā)現(xiàn),小麥粗糧組微生物豐度最高,其次是黑小麥粗糧和燕麥粗糧。Shannon和Simpson指數(shù)反映的是群落的多樣性,與陰性對照組相比,在體外添加基質(zhì)發(fā)酵后微生物多樣性均降低,可能原因是體外模擬發(fā)酵環(huán)境下添加基質(zhì)對腸道菌群的刺激導(dǎo)致;與陽性對照組相比,粗糧發(fā)酵后微生物多樣性降低,因?yàn)榈途酃潜还J(rèn)為一種益生元,能夠被腸道菌群利用,維持腸道菌群的多樣性[19],這和本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。三種粗糧之間比較,黑小麥粗糧發(fā)酵后微生物多樣性指數(shù)高于其他兩組粗糧發(fā)酵,可能是因?yàn)楹谛←滬熎ぶ蠺DF含量高于其他兩種麩皮所導(dǎo)致。麩皮中含有豐富的膳食纖維和植物活性成分,大部分的物質(zhì)是不能被人體內(nèi)源性酶所消化,而直接進(jìn)入大腸被腸道菌群所分解利用,研究發(fā)現(xiàn),在面粉中添加15%的麩皮的粗糧制品經(jīng)體外發(fā)酵腸道菌群的多樣性降低,不同粗糧對腸道菌群多樣性的影響不一樣。

表2 多樣性指數(shù)Table 2 Diversity index

圖1 Shannon曲線圖(A)和OTU稀釋曲線(B)Fig.1 Shannon curves(A)and OTU rank curve(B)注:1陰性對照組;2陽性對照組;3小麥粗糧組;4黑小麥粗糧組;5燕麥粗糧組。

2.3 物種組成分析

物種在門的水平上進(jìn)行組成分析,結(jié)果如圖2所示,大腸中腸道菌群主要是由擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)兩大類組成,占總細(xì)菌的85%以上,其次是變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria),與李旻[20]和Schuurman T等[21]報(bào)道相一致。與陰性對照組相比,粗糧發(fā)酵后腸道菌群在門的水平組成上發(fā)生了顯著變化,擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度下降,厚壁菌門相對豐度升高,可能是麩皮中物質(zhì)刺激了厚壁菌門生長,抑制了擬桿菌門的生長,這與Zhao等[22]研究結(jié)果一致,Zhao用了五種全谷物在體外模擬發(fā)酵發(fā)現(xiàn),添加全谷物體外發(fā)酵擬桿菌水平下降。與陰性對照組相比(放線菌門相對豐度為0.1%),加入發(fā)酵基質(zhì)后,放線菌門相對豐度升高,低聚果糖組高達(dá)6.86%,小麥粗糧、黑小麥粗糧和燕麥粗糧放線菌門相對豐度分別為1.82%、1.29%和2.70%。如圖2所示,陰性對照組中細(xì)菌總數(shù)最少,小麥粗糧組中細(xì)菌總數(shù)最多,其次是燕麥粗糧組、陽性對照組、黑小麥粗糧組,這表明添加發(fā)酵基質(zhì)后,能夠刺激或者維持細(xì)菌的生長。

圖2 物種門分類水平柱狀圖(A)與絕對豐度柱狀圖(B)Fig.2 The taxonomic composition distribution in samples of phylumlevel(A)and absolute abundance of phylumlevel(B)注:1代表陰性對照組;2代表陽性對照組;3代表小麥粗糧組;4代表黑小麥粗糧組;5代表燕麥粗糧組。

體外發(fā)酵后對腸道菌群測序結(jié)果見圖3,由圖3A可知,厚壁菌門主要由巨單胞菌屬(Megamonas)、巨型球菌屬(Megasphaera)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、布勞特氏菌屬(Blautia)、Dorea菌屬和顫螺菌屬(Oscillospira)組成;添加低聚果糖發(fā)酵后,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)相對豐度最高,達(dá)3.5%;小麥粗糧、黑小麥粗糧和燕麥粗糧發(fā)酵后乳酸桿菌豐度分別為0.051%、0.003%和0.021%,粗糧組中，小麥粗糧組發(fā)酵后乳酸桿菌豐度最高,是其他兩種粗糧的2倍,Jose等[23]在肥胖糖尿病小鼠中添加全谷小麥,乳酸桿菌相對豐度比對照組增大了三倍。與陽性對照組相比,粗糧在體外發(fā)酵后,巨單胞菌屬(Megamonas)和巨型球菌屬(Megasphaera)豐度增加,占總細(xì)菌豐度的60%以上。從圖3B可以看出,擬桿菌門主要由擬桿菌屬(Bacteroides)、普斯菌屬(Prevotella)和副桿狀菌屬(Parabacteroides)組成。雙歧桿菌(Bifidobacterium)是一種益生菌,由圖3C可知,與陰性對照組相比,三種粗糧能增加雙歧桿菌的相對豐度(小麥粗糧、黑小麥粗糧和燕麥粗糧雙歧桿菌相對豐度分別為1.79%、1.23%和2.62%),這是由于麩皮中有益成分刺激了雙歧桿菌的生長,不同麩皮中膳食纖維和植物活性成分的含量以及理化性質(zhì)的差異,對刺激雙歧桿菌的生長會(huì)有一定的影響,三種粗糧相比較,燕麥粗糧發(fā)酵后,更好地促進(jìn)了雙歧桿菌的生長,這與Zhang和Shen等[2425]研究結(jié)果一致,燕麥麩皮和燕麥β葡聚糖能夠增加小鼠體內(nèi)雙歧桿菌的生長。

圖3 厚壁菌門在屬的分類水平柱狀圖(A)、擬桿菌門在屬的分類水平柱狀圖(B)以及雙歧桿菌相對豐度柱狀圖(C)Fig.3 The taxonomic composition distribution in samples of genuslevel Firmicutes(A)，Bacteroidetes(B)and Bifidobacterium(C)注:1陰性對照組;2陽性對照組;3小麥粗糧組;4黑小麥粗糧組;5燕麥粗糧組。

2.4 代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(SCFA)分析

發(fā)酵48 h后,對主要的短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)進(jìn)行了定性定量分析。圖4為短鏈脂肪酸的色譜圖,用外標(biāo)法對乙酸、丙酸和丁酸進(jìn)行定量,結(jié)果見表3,由表3可知,添加發(fā)酵基質(zhì)后,產(chǎn)生的乙酸、丙酸和丁酸含量都顯著高于(p<0.05)陰性對照組。三種粗糧相比較,小麥粗糧發(fā)酵后產(chǎn)生的丙酸含量高于其他兩組粗糧,這是因?yàn)樾←湸旨Z發(fā)酵后巨單胞菌屬和巨行球菌屬相對豐度高于其他兩組粗糧,而這兩種細(xì)菌是產(chǎn)丙酸鹽的細(xì)菌[26],故小麥粗糧發(fā)酵后丙酸含量增加。

圖4 短鏈脂肪酸氣相色譜圖Fig.4 Chromatograms of SCFA

表3 短鏈脂肪酸含量(mmol/L)Table 3 The content of SCFA(mmol/L)

3 結(jié)論

在面粉中添加15%麩皮發(fā)酵后,降低了腸道菌群的豐富度和多樣性,腸道菌群的組成發(fā)生了較大的變化,擬桿菌門相對豐度水平降低,厚壁菌門相對豐度水平升高,產(chǎn)丙酸鹽細(xì)菌巨單胞菌屬和巨型球菌屬相對豐度增加,發(fā)酵液中短鏈脂肪酸含量也顯著增加(p<0.05);同時(shí)粗糧粉發(fā)酵后,增大了雙歧桿菌和乳酸桿菌的相對豐度,表明在面制品中添加麩皮能夠有效的調(diào)節(jié)腸道菌群,促進(jìn)腸道中有益菌的增殖。

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