棘孢木霉液體發(fā)酵條件優(yōu)化

宋巧英,朱振元

(食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

木霉對人類的實(shí)用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值逐漸被發(fā)現(xiàn),主要因其具有抑菌[1]、產(chǎn)抗生素[2]、產(chǎn)纖維素酶[3]、促生[4]和抗重金屬[5]等作用。尤其綠色木霉如棘孢木霉(T.asperellum)、深綠木霉(T.atroviride)、哈茨木霉(T.harzianum)已被人類認(rèn)識并利用,且商業(yè)化木霉已問世[67]。有研究報(bào)道綠色木霉具有產(chǎn)纖維素酶的能力[8],其胞外多糖具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用[9]。其中棘孢木霉是一類重要的綠色木霉并具有極大的潛力。棘孢木霉可產(chǎn)生不同的細(xì)胞壁水解酶如幾丁質(zhì)酶、外切β1,3葡聚糖酶、N乙酰氨基葡萄糖苷酶等[10],且具有促進(jìn)植物防御體系,抵抗黒莢果病[11]及降解農(nóng)作物鉛含量的作用[12]。傳統(tǒng)的棘孢木霉培養(yǎng)方法是固體培養(yǎng)[13],關(guān)于棘孢木霉液體發(fā)酵條件優(yōu)化的報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)以菌絲體干重和孢子數(shù)為指標(biāo)，通過單因素、正交實(shí)驗(yàn)對棘孢木霉液體搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。旨在降低發(fā)酵成本,縮短發(fā)酵周期,為棘孢木霉的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉 天津科技大學(xué)生物資源與功能食品實(shí)驗(yàn)室在4 ℃冰箱保存;葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、蔗糖、麥芽糖、乳糖、酵母浸粉、牛肉膏、氯化銨、CuSO4、MnCl2、ZnSO4、FeSO4、HCl、NaOH等 均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;馬鈴薯、黃豆粉、綠豆粉、全麥粉 市售。

DSX280KB24手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;202B恒溫培養(yǎng)搖床 天津歐諾儀器股份有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂18 g,蒸餾水1000 mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

黃豆粉培養(yǎng)基:黃豆粉0.25%葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

全麥粉培養(yǎng)基:全麥粉 0.25% 葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

綠豆粉培養(yǎng)基:綠豆粉 0.25% 葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化 將菌種接種到配制好的PDA斜面培養(yǎng)基中,26 ℃,培養(yǎng)3 d,重復(fù)三次即可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)[14]。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 分別取黃豆粉培養(yǎng)基、全麥粉培養(yǎng)基和綠豆粉培養(yǎng)基各100 mL于250 mL錐形瓶中,于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。將活化好的菌種配制成4×108個(gè)/mL濃度的孢子懸浮液,每100 mL培養(yǎng)基加樣量為2 mL,于26 ℃,160 r/min培養(yǎng)3 d。將錐形瓶取出,搖勻后取1 mL稀釋100倍,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),最后得出每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù),為數(shù)據(jù)處理方便,以孢子數(shù)對數(shù)值為指標(biāo)。然后將發(fā)酵液搖勻進(jìn)行抽濾,得到菌絲體,將菌絲體烘干至恒重,稱量菌絲體的質(zhì)量,計(jì)為菌絲體干重。每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù),結(jié)果取其平均值,并計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差。

1.3.2.2 黃豆粉量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 根據(jù)上述篩選出的黃豆粉培養(yǎng)基來確定黃豆粉最佳量。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別配制含有黃豆粉0.1%,0.2%,0.25%,0.3%,0.35%,0.4%,0.5%的培養(yǎng)基,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.3 不同碳源對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)黃豆粉添加量為0.25%,黃豆粉培養(yǎng)基中分別用2%的蔗糖、麥芽糖、乳糖代替葡萄糖,并做對照。按照1.3.2.1的方法測定孢子數(shù)和干重。

1.3.2.4 葡萄糖添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)葡萄糖為碳源,黃豆粉培養(yǎng)基中的葡萄糖分別設(shè)置為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.5 不同氮源對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)葡萄糖添加量為3.0%,在篩選出的黃豆粉培養(yǎng)基中分別用0.25%的酵母浸粉、牛肉膏、氯化銨代替蛋白胨,并做對照。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.6 蛋白胨添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)?shù)鞍纂藶榈?黃豆粉培養(yǎng)基中的蛋白胨添加量分別設(shè)置為0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.7 不同微量元素對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?.75%,黃豆粉培養(yǎng)基中分別用0.15%的CuSO4、MnCL2、ZnSO4、FeSO4代替MgSO4,并做對照。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.8 Mg2+添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)MgSO4為微量元素,黃豆粉培養(yǎng)基中的Mg2+添加量分別設(shè)置為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.9 光照條件對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)Mg2+添加量為0.15%,黃豆粉培養(yǎng)基分別置于完全光照,完全黑暗,自然光照中培養(yǎng)3 d。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.10 溫度對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)自然光照棘孢木霉生長,黃豆粉培養(yǎng)基分別置于20、25、30、35 ℃中培養(yǎng)3 d。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.11 初始pH對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)適合棘孢木霉生長溫度為25 ℃,用0.1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)篩選出的最佳培養(yǎng)基的pH,將上述篩選出的黃豆粉培養(yǎng)基的初始pH分別調(diào)整為4、6、7、9、11。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.12 裝瓶量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)適合棘孢木霉生長的培養(yǎng)基初始pH為7時(shí),黃豆粉培養(yǎng)基按每250 mL錐形瓶裝液量分別為40、60、80、100、120、160 mL進(jìn)行培養(yǎng)。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.2.13 接種量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 當(dāng)裝瓶量為100 mL時(shí),黃豆粉培養(yǎng)基接種量分別按0.5×106、1×106、2×106、4×106、8×106、16×106個(gè)/mL進(jìn)行培養(yǎng)。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數(shù)。

1.3.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平 由上述實(shí)驗(yàn)可知,接種量、裝瓶量、蛋白胨添加量和葡萄糖添加量對干重和孢子數(shù)的影響較為顯著。因此在單因素基礎(chǔ)上將這四個(gè)因素作為正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素,正交表見表1。

表1 棘孢木霉發(fā)酵因素水平Table 1 Factors and levels affecting the fermentation of Trichoderma asperellum

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用EXCEL和SAS 9.3軟件進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同培養(yǎng)基對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表2可知,棘孢木霉在不同培養(yǎng)基中均能生長,且在黃豆粉培養(yǎng)基中生長最旺:菌絲體干重為8.822 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為7.3281。其次是綠豆粉培養(yǎng)基,而在全麥粉培養(yǎng)基中生長最弱。由于黃豆粉中含有大量的蛋白質(zhì)和碳水化合物,為棘孢木霉的生長提供額外的碳源和氮源。因此選取黃豆粉培養(yǎng)基為培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 2 Effects of different media on the number and dry weight of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.2 黃豆粉量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表3可知,黃豆粉量的不同對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響有顯著性差異(p<0.05)。隨著黃豆粉量的增加,菌絲體干重和孢子數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。其中黃豆粉量為0.25%時(shí),干重和孢子數(shù)達(dá)到最大,其中干重為12.704 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.6232。因此黃豆粉為0.25%。

表3 黃豆粉量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 3 Effects of soybean powder on dryweight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.3 不同碳源對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表4可知不同的碳源對菌絲體干重的影響有極顯著性差異(p<0.01),對孢子數(shù)有顯著性差異(p<0.05)。其中葡萄糖作為碳源培養(yǎng)基所得菌絲體干重和孢子數(shù)達(dá)到最大,干重為9.974 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.7782。由于葡糖糖可以被棘孢木霉直接利用,因此選取葡萄糖為碳源。

表4 不同碳源對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 4 Effects of carbon source on dry weight and spore number of mycelia

2.1.4 葡萄糖添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表5可知葡萄糖添加量對菌絲體干重的影響有極顯著性差異(p<0.01),對孢子數(shù)有顯著性差異(p<0.05)。菌絲體干重和孢子數(shù)隨著葡萄糖量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中葡萄糖量為3.0%時(shí)菌絲體干重最大,達(dá)到16.672 g/L,當(dāng)葡萄糖量為2%時(shí)每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)達(dá)到最大為8.7782。這是由于葡萄糖添加量增多或減少會導(dǎo)致培養(yǎng)基的碳氮比失衡,因此葡萄糖添加量為3.0%。

表5 葡萄糖添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 5 Effects of glucose addition on dry wight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.5 不同氮源對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表6可知不同氮源對菌絲體干重的影響有顯著性差異(p<0.05),對孢子數(shù)有極顯著性差異(p<0.01)。其中蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基所得菌絲體干重和孢子數(shù)達(dá)到最大值。干重為10.989 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.6127。因此選取蛋白胨為氮源。

表6 不同氮源對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 6 Effects of different nitrogen sources on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.6 蛋白胨添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表7可知蛋白胨的添加量對菌絲體干重?zé)o顯著影響(p>0.05)，而對孢子數(shù)有顯著性影響(p<0.05)，菌絲體干重和孢子數(shù)隨著蛋白胨量的增加呈現(xiàn)增加趨勢。當(dāng)?shù)鞍纂肆繛?.25%時(shí)干重和孢子數(shù)最大，其中干重為12.455 g/L，每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.3010。因此蛋白胨添加量為1.25%。

表7 蛋白胨添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 7 Effects of peptone additive on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.7 不同微量元素對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表8可知不同微量元素對菌絲體干重的影響有顯著性差異(p<0.05)。其中MgSO4作為微量元素的培養(yǎng)基所得菌絲體干重和孢子數(shù)達(dá)到最大值,干重為8.709 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.5051。因此選取MgSO4為微量元素。

表8 不同微量元素對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 8 Effects of different trace elements on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.8 Mg2+添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表9可知Mg2+添加量對菌絲體干重有顯著性影響(p<0.05),對孢子數(shù)對數(shù)值有極顯著性影響(p<0.01)。菌絲體干重和孢子數(shù)隨著Mg2+添加量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中當(dāng)Mg2+添加量為0.15%時(shí),干重和孢子數(shù)對數(shù)值達(dá)到最大值,干重為9.752 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.1139。所以Mg2+添加量為0.15%。

表9 Mg2+添加量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 9 Effects of Mg2+ on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.9 光照條件對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表10可知光照條件對干重和孢子數(shù)有極顯著性影響(p<0.01)。其中自然光照條和全光照條件下菌絲體干重和孢子數(shù)無差異(p>0.01)。由于自然光照會降低成本,因此選取自然光照條件下進(jìn)行發(fā)酵,干重為13.885 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.3792。

表10 光照條件對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 10 Effects of light conditions on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.10 溫度對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表11可知,溫度對干重和孢子數(shù)有極顯著性影響(p<0.01)。其中當(dāng)溫度為25 ℃時(shí),干重和孢子數(shù)對數(shù)值達(dá)到最大,干重為13.956 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.1968。所以選取發(fā)酵溫度為25 ℃。這和李琳實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[14]。

表11 溫度對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 11 Effects of temperature on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.11 初始pH對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表12可知,初始pH對菌絲體干重和孢子數(shù)有顯著性影響(p<0.05)。其中當(dāng)pH為7時(shí),菌絲體干重和孢子數(shù)達(dá)到最大值,干重為8.200 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.6127。由于培養(yǎng)基過酸或過堿都會破壞棘孢木霉酶活性,因此選取初始pH為7。

表12 初始pH對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 12 Effects of initial pH on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.12 裝瓶量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表13可知裝瓶量對菌絲體干重和孢子數(shù)有顯著性影響(p<0.05)。菌絲體干重和孢子數(shù)隨著裝瓶量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中當(dāng)裝瓶量為100 mL/250 mL時(shí),菌絲體干重和孢子數(shù)達(dá)到最大,每毫升發(fā)酵液中菌絲體干重為13.737 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.8445。因?yàn)?00 mL/250 mL裝瓶量會使氧氣充足同時(shí)營養(yǎng)條件合適,所以選取裝瓶量為100 mL/250 mL。

表13 裝瓶量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 13 Effects of bottling amount on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.13 接種量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響 由表14可知接種量對菌絲體干重有極顯著性影響(p<0.01),對孢子數(shù)有顯著性影響(p<0.05)。菌絲體干重和孢子數(shù)隨著接種量的增加呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。其中當(dāng)接種量為8×106個(gè)/mL時(shí),干重和孢子數(shù)達(dá)到最大值,干重為15.196 g/L,每毫升發(fā)酵液中孢子數(shù)對數(shù)值為8.7993。所以選取接種量為8×106個(gè)/mL。

表14 接種量對菌絲體干重和孢子數(shù)的影響(x±SD,n=3)Table 14 Effects of inoculation amount on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表15可以看出,對干重的影響的顯著順序依次為:裝瓶量>葡萄糖添加量>接種量>蛋白胨添加量,四個(gè)因素的最佳組合為A2B4C4D4。對孢子數(shù)的影響的顯著順序依次為:葡萄糖添加量>接種量>裝瓶量>蛋白胨添加量,四個(gè)因素的最佳組合為A2B4C4D4。所以,得到的最佳培養(yǎng)基配方為:黃豆粉0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,接種量8×106個(gè)/mL,裝瓶量100 mL/250 mL,蛋白胨添加量1.35%,葡萄糖添加量3.5%,轉(zhuǎn)速160 r/min,溫度25 ℃,自然光照,pH為7。

表15 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 15 Results and analysis of orthogonal test

3 結(jié)論

基于棘孢木霉的巨大潛力,對棘孢木霉的液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。通過單因素正交實(shí)驗(yàn)確定液體發(fā)酵最優(yōu)條件為:黃豆粉0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,接種量8×106個(gè)/mL,裝瓶量100 mL/250 mL,蛋白胨添加量1.35%,葡萄糖添加量3.5%,轉(zhuǎn)速160 r/min,溫度25 ℃,自然光照,pH為7。以黃豆粉浸提液為主要培養(yǎng)基是因?yàn)辄S豆粉來源豐富,營養(yǎng)豐富,價(jià)格低廉。在微量元素利用方面,Fe2+和Cu2+會抑制菌絲體和孢子數(shù)的增長,這和柯仿鋼[15]等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在裝瓶量方面,100 mL/250 mL的裝瓶量為最佳裝瓶量,這是因?yàn)檠鯕獬渥?且營養(yǎng)條件合適,適合菌體生長,這和李琳[12]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。雖然武為平[16]等也研究了棘孢木霉產(chǎn)厚垣孢子的液體發(fā)酵條件,其產(chǎn)孢量達(dá)到5×107個(gè)/mL,本研究的產(chǎn)孢量為4.4812×109個(gè)/mL,因此本研究的發(fā)酵條件優(yōu)化成效顯著。這對于棘孢木霉的綜合開發(fā)和利用具有重要的價(jià)值。為棘孢木霉的工業(yè)化生產(chǎn)打下理論基礎(chǔ)。

表16 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(x±SD,n=3)Table 16 Verify the experiment(x±SD,n=3)

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