抑制Akt／PKB信號(hào)通路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞凋亡

劉惠莉

牙周炎是一類高發(fā)性的口腔炎癥疾病，嚴(yán)重危害人類口腔健康，并與全身健康和諸多疾病有著密切的關(guān)系，在全球有著極高的發(fā)病率［1］。

近年來研究發(fā)現(xiàn)牙周炎主要是厭氧菌的混合感染，缺氧環(huán)境更有利于厭氧型致病菌的生長(zhǎng)和繁殖，因此缺氧環(huán)境會(huì)加重牙周炎病變過程，影響牙周組織的防御和修復(fù)，并直接誘導(dǎo)牙周組織細(xì)胞的凋亡［2］。牙周膜成纖維細(xì)胞（hPDLFs）是牙周組織內(nèi)的主要組成成分，其生物活性與牙周炎的發(fā)生密切相關(guān)［3］。

缺氧誘導(dǎo)的hPDLFs凋亡與牙周炎密切相關(guān)［4］。缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）由α和 β兩個(gè)亞基組成，HIF-1α蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)，常氧條件下迅速降解。在缺氧的條件下，HIF-1α含量則顯著提高，與含缺氧反應(yīng)元件的下游基因結(jié)合，激活缺氧應(yīng)答基因調(diào)控系統(tǒng)的缺氧應(yīng)答反應(yīng)［5］。

本文主要研究在缺氧條件下，抑制Akt／PKB信號(hào)通路對(duì)hPDLFs凋亡的影響，為進(jìn)一步闡明牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器

hPDLFs（BioWhittaker公司，美國）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；厭氧產(chǎn)氣袋AnaeroPack（三菱公司，日本）；FITC-Annexin V、Propidium Iodide（BD Biosciences Pharmingen公司，美國）；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、si-Akt、si-control（Introvigen公司，美國）；Fast SYBR Green mastermix kit（Applied Biosystems公司，美國）；HIF-α單抗、pAktser473單抗、t-Akt單抗、βactin抗體及酶標(biāo)二抗（CST公司，美國）；流式細(xì)胞儀（BD公司，F(xiàn)ACSCalibur，美國）；PCR儀 （ABI公司，9700，美國）。其他常用試劑購自上海生工公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

從液氮中快速取出hPDLFs，復(fù)蘇后，用含有4 ml DMEM培養(yǎng)基的25 cm2的培養(yǎng)瓶在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞缺氧處理

將hPDLFs接種入培養(yǎng)瓶，放入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋AnaeroPack，產(chǎn)生CO2，減少氧氣含量至1%左右，扎口密封，放入細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取hPDLFs以7.5×104／孔的密度接種于6孔板中，5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)4 h。采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染，分別將si-Akt和si-control轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和缺氧48 h處理的hPDLFs，培養(yǎng)48 h后收集并消化細(xì)胞，接種在6孔板中，PBS洗滌3次，使用500μl binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／孔，各孔加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI混勻，室溫避光放置10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.6 qRT-PCR

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和缺氧48 h處理的hPDLFs常規(guī)培養(yǎng)，用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA。以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。加入熒光染料SYBR Green，在ABI 7900 qRT-PCR系統(tǒng)，以U6 snRNA為相對(duì)定量的內(nèi)參進(jìn)行HIF-1α蛋白mRNA的擴(kuò)增。

1.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和缺氧48 h處理的hPDLFs，培養(yǎng)48 h后消化收集，加入RIPA裂解液提取總蛋白，進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，將單抗HIF-α、p-Akt、t-Akt、Bcl-2、Bax在4℃條件下孵育過夜，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記），室溫孵育1 h，ECL顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.8 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和缺氧48 h處理的hPDLFs進(jìn)行消化收集，以1×105／孔的密度接種于96孔板中，37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后，加入10 μl MTT溶液，孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO蕩搖勻后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm的吸光值。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 缺氧抑制hPDLFs的增殖

在12、24、48、72 h時(shí)，缺氧組的細(xì)胞增殖率明顯低于常氧組（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 缺氧抑制hPDLFs增殖Fig 1 Proliferation inhibition of hPDLFs by hypoxia

2.2 缺氧促進(jìn)hPDLFs凋亡

與常氧組相比，缺氧組的hPDLFs的凋亡率明顯提高（圖2A、2B）。缺氧組的Bax蛋白表達(dá)量明顯提高，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，Bax／Bcl-2的比值明顯提高（圖2C）。說明缺氧顯著促進(jìn)hPDLFs凋亡。

2.3 缺氧促進(jìn)HIF-1α蛋白的表達(dá)

缺氧組的HIF-1α表達(dá)量明顯高于常氧組（圖3A），而HIF-1α的mRNA表達(dá)沒有明顯的變化（圖3B）。結(jié)果說明缺氧顯著促進(jìn)HIF-1α的蛋白表達(dá)。

2.4 缺氧抑制Akt／PKB信號(hào)通路

與常氧組相比，pAktser473的表達(dá)量明顯降低，而總Akt的表達(dá)量沒有明顯變化（P＜0.05），說明缺氧明顯抑制了Akt／PKB信號(hào)通路（圖4）。

2.5 抑制 Akt／PKB信號(hào)通路促進(jìn)缺氧條件下HIF-1α的蛋白表達(dá)

在缺氧條件下，si-Akt明顯降低了pAktser473的表達(dá)，而總Akt的表達(dá)量沒有明顯變化，si-Akt抑制了Akt／PKB信號(hào)通路（圖 5）；在缺氧條件下，si-Akt組的HIF-1α蛋白表達(dá)明顯高于si-control組，說明si-Akt顯著抑制Akt／PKB信號(hào)通路，且明顯提高了缺氧條件下HIF-1α蛋白的表達(dá)（圖5）。

2.6 抑制Akt／PKB信號(hào)通路增強(qiáng)缺氧對(duì)的hPDLFs增殖的抑制

將si-Akt和 si-control轉(zhuǎn)染 hPDLFs以研究 Akt／PKB信號(hào)通路抑制對(duì)hPDLFs增殖的影響。結(jié)果顯示，在缺氧條件下，si-Akt組的hPDLFs增殖抑制率明顯高于si-control組，且在24、48、72 h時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6）。說明抑制Akt／PKB信號(hào)通路促進(jìn)缺氧對(duì)hPDLFs增殖的抑制。

圖2 缺氧誘導(dǎo)hPDLFs的凋亡Fig 2 Apoptosis of hPDLFs induced by hypoxia

圖3 缺氧提高h(yuǎn)PDLFs HIF-1α蛋白的表達(dá)Fig 3 HIF-1αexpression in hPDLFs

圖4 缺氧抑制Akt／PKB信號(hào)通路Fig 4 Inhibition of Akt／PKB signaling pathway by hypoxia

2.7 抑制 Akt／PKB信號(hào)通路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的 hPDLFs的凋亡

在缺氧條件下，與 si-control對(duì)照組相比，si-Akt組的 hPDLFs凋亡率 明顯提高（P＜0.05）（圖 7A）。Westernblot結(jié)果表明，與si-control組相比，si-Akt組的Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯減少，Bax蛋白表達(dá)量明顯增加，Bax／Bcl-2的比值明顯提高（圖 7B）。說明抑制Akt／PKB信號(hào)通路顯著促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)hPDLFs的凋亡。

圖5 抑制Akt／PKB信號(hào)通路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α蛋白表達(dá)Fig 5 Promotion of HIF-1αexpression by the inhibition of Akt／PKB signaling pathway hypoxic-induced reduction of HIF-1αlevel

圖6 抑制Akt／PKB信號(hào)通路增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的hPDLFs增殖抑制Fig 6 Increase of the inhibition of hypoxia induced proliferation of hPDLFs by inhibition of Akt／PKB signaling pathway

3 討 論

圖7 抑制Akt／PKB信號(hào)通路促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的hPDLFs的凋亡Fig 7 Increase of hypoxia-induced apoptosis of hPDLFs by the inhibition of Akt／PKB signaling pathway

細(xì)胞凋亡是在正常生理或病理狀態(tài)下機(jī)體細(xì)胞發(fā)生的一種自發(fā)的、程序化的死亡過程，是細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的主要形式。細(xì)胞在缺氧條件下，細(xì)胞核中HIF-1α蛋白顯著增加，引發(fā)一系列細(xì)胞缺氧反應(yīng)［6］。本研究發(fā)現(xiàn)hPDLFs在缺氧條件下的凋亡率明顯高于常氧條件下的凋亡率，說明缺氧促進(jìn)了hPDLFs的凋亡，且缺氧條件下的HIF-1α蛋白表達(dá)量明顯增加，HIF-1α mRNA沒有明顯的變化，常氧條件下幾乎無HIF-1α的表達(dá)。研究表明缺氧對(duì)HIF-1αmRNA水平?jīng)]有影響，但可以顯著影響蛋白水平變化，可能是對(duì)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。在缺氧的條件下，細(xì)胞核中HIF-1α蛋白顯著增加，同時(shí)HIF-1β亞基從胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中，與細(xì)胞核中的HIF-1α形成異二聚體。HIF-1異二聚體與含缺氧反應(yīng)元件的下游基因結(jié)合，激活缺氧應(yīng)答基因調(diào)控系統(tǒng)的缺氧應(yīng)答反應(yīng)，引發(fā)一系列細(xì)胞缺氧反應(yīng)［7］。

Akt／PKB參與了多個(gè)細(xì)胞過程。SARS冠狀病毒膜蛋白通過激活caspase-8和caspase-9并抑制PDK1與Akt／PKB信號(hào)通路的相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。環(huán)氧化酶抑制劑SC236通過下調(diào)Akt的表達(dá)和上調(diào)Cyt-C的表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡［9］。Baran等［10］發(fā)現(xiàn)Akt／PKB信號(hào)通路可以作為介導(dǎo)小鼠胚胎細(xì)胞抗凋亡信號(hào)的主要靶標(biāo)。在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明缺氧顯著促進(jìn)hPDLFs的凋亡，抑制細(xì)胞增殖，抑制Akt／PKB信號(hào)通路，并且抑制Akt／PKB信號(hào)通路顯著促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的hPDLFs的凋亡，增強(qiáng)缺氧誘導(dǎo)的hPDLFs增殖抑制，提高HIF-1α蛋白的表達(dá)，為牙周炎發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)。

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