細(xì)胞色素P450 2C9*8與CYP2C9*27慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及在HEK239T細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)

廖　凱, 劉　勇, 萬子衿, 李　巍

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 3. 大連理工大學(xué) 生命與醫(yī)藥學(xué)院, 遼寧 盤錦, 124221)

CYP2C9是人體內(nèi)重要的藥物I相代謝酶，參與了超過15%臨床藥物的代謝清除[1], 其底物包括S-華法林、苯妥英、雙氯芬酸、格列甲嗪和甲苯磺丁脲等。CYP2C9基因具有高度的多態(tài)性，目前已發(fā)現(xiàn)超過60種CYP2C9突變體。這些基因多態(tài)性可能影響其底物藥的代謝速率及血藥濃度，在藥物不良反應(yīng)中起到了關(guān)鍵作用[2-3]。故研究CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)臨床安全用藥、藥物不良反應(yīng)的預(yù)測(cè)及指導(dǎo)合理用藥具有重要的意義。

CYP2C9*8 (449G>A)為非裔美國人CYP2C9常見的單堿基突變[4-5], 而在亞洲人中該位點(diǎn)常見突變?yōu)镃YP2C9*27 (499G>T), 在蛋白序列上CYP2C9蛋白上150位精氨酸分別突變?yōu)橘嚢彼岷徒M氨酸[2, 6]。體外數(shù)據(jù)[7-8]表明，在對(duì)催化底物代謝速率的影響上, CYP2C9*8與CYP2C9*27表現(xiàn)出了不同的選擇性。這兩種突變均導(dǎo)致CYP2C9的底物氯沙坦等藥物的代謝清除速率降低。CYP2C9*8代謝雙氯芬酸和氟西汀的速率與野生型CYP2C9相比均下降，而CYP2C9*27催化雙氯芬酸和氟西汀代謝的速率與野生型并無顯著差異[9-10]。此外CYP2C9*8代謝清除苯妥英速率降低，而CYP2C9*27卻導(dǎo)致了代謝清除速率的顯著上升[11]。目前CYP2C9*8與CYP2C9*27突變體對(duì)酶活性影響的機(jī)制仍未完全明確，因此構(gòu)建CYP2C9*8與CYP2C9*27的表達(dá)體系，對(duì)研究底物代謝的變化和催化機(jī)制十分必要。

細(xì)胞色素P450(CYPs)為膜蛋白，大腸桿菌表達(dá)CYPs后與脂質(zhì)重構(gòu)是目前常見的表達(dá)CYPs的方法之一[12], 另外常用的真核表達(dá)模型為昆蟲細(xì)胞模型，具有表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)，但沒有足夠的輔酶表達(dá)以支持反應(yīng)[13]。這些模型可能在蛋白修飾或脂質(zhì)構(gòu)成上與人存在種屬差異，可能導(dǎo)致使用這些模型獲得的數(shù)據(jù)與人體數(shù)據(jù)存在差異。另外目前也缺乏穩(wěn)定表達(dá)CYP2C9*8與CYP2C9*27的人源化體系。因此本研究通過建立慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，將CYP2C9*8與CYP2C9*27穩(wěn)定表達(dá)于人HEK293T細(xì)胞，對(duì)于CYP2C9*8與CYP2C9*27的功能和催化機(jī)制研究是一個(gè)有效的模型。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒(PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase)、DL 5000 DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、EcoR I限制性內(nèi)切酶、Xho I限制性內(nèi)切酶、E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自Takara公司, T4連接酶購自NEB公司，膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司, MigR1、pCMV-VSV-G與pCMV-Gag-Pol質(zhì)粒由揚(yáng)州大學(xué)郁多男教授惠贈(zèng), HEK293T細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)鄭英教授惠贈(zèng), TRIzol、lipofectamine 2000購自Invitrogen公司, CYP2C9抗體購自Bio-rad公司, β-actin抗體、HRP-山羊抗小鼠二抗和HRP-山羊抗兔二抗購自中杉金橋公司。

1.2　重組質(zhì)粒的構(gòu)建

TRIzol法提取人肝組織總RNA, 并逆轉(zhuǎn)錄。采用帶有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的CYP2C9編碼區(qū)的上下游引物(CYP2C9-RE-F與CYP2C9-RE-R，引物序列見表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃ 5 min; 94 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s, 30個(gè)循環(huán); 72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物采用EcoR I和 Xho I進(jìn)行雙酶切，純化后采用T4 DNA連接酶與EcoR I和 Xho I雙酶切后的MigR1質(zhì)粒進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E. coli DH5α, 雙酶切篩選陽性克隆并送生工公司測(cè)序。獲得CYP2C9的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，命名為MigR1-CYP2C9。

用重疊PCR方法構(gòu)建CYP2C9*8與CYP2C9*27編碼序列。采用含有449位G>A的正義引物(CYP2C9*8-F)與CYP2C9-RE-R組合，含有449位G>A的反義引物(CYP2C9*8-R)與CYP2C9-RE-F組合，以MigR1-CYP2C9為模板，分別PCR擴(kuò)增獲得兩段產(chǎn)物。將這兩段產(chǎn)物組合進(jìn)行重疊PCR反應(yīng)，獲得含有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的CYP2C9*8的編碼序列。采用含有449位G>T的正義引物CYP2C9*27-F與CYP2C9-RE-R組合，含有449位G>T的反義引物CYP2C9*27-R與CYP2C9-RE-F組合，同樣方法獲得含有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的CYP2C9*27的編碼序列。限制性內(nèi)切酶酶切CYP2C9*8與CYP2C9*27編碼序列后并連接至MigR1載體，篩選陽性克隆并測(cè)序鑒定。獲得CYP2C9*8與CYP2C9*27的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，命名為MigR1-CYP2C9*8與MigR1-CYP2C9*27。引物序列見表1。

表1　引物序列

1.3　表達(dá)CYP2C9、CYP2C9*8與CYP2C9*27的細(xì)胞株的建立

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于3×105/孔的密度接種于6孔板后培養(yǎng)24 h, 用Lipfectamine 2000將MigR1、MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8或MigR1-CYP2C9*27分別與病毒包裝質(zhì)粒GAG-POL和VSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(DNA分別為1.8、0.6和0.6 μg), 5 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。24 h后收集培養(yǎng)基上清，采用0.45 μm濾膜過濾，獲得含慢病毒的培養(yǎng)基，加入聚凝胺(終濃度10 μg/mL)。293T細(xì)胞(3×105/孔)接種于6孔板后培養(yǎng)24 h, 更換培養(yǎng)基為上一步獲得的含病毒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，更換培養(yǎng)基為RPIM1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 KU/L青霉素和100 mg/鏈霉素)。傳代至100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)后，進(jìn)行流式分選，稀釋至6個(gè)/mL, 接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿(5 mL), 培養(yǎng)72 h。于熒光顯微鏡下觀察，挑取表達(dá)綠色熒光蛋白的克隆至24孔板中。細(xì)胞傳代30代后綠色熒光蛋白仍穩(wěn)定表達(dá)，細(xì)胞命名為293T-MigR1、293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27。

1.4　胞內(nèi)CYP2C9表達(dá)水平的檢測(cè)

1.4.1qRT-PCR檢測(cè)CYP2C9的mRNA水平: Trizol法提取293T-MigR1、293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用SYBR Green qRT-PCR方法，利用2-ΔΔCt對(duì)CYP2C9的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。CYP2C9和GAPDH的qRT-PCR引物序列見參考文獻(xiàn)[14]。

1.4.2Western Blot檢測(cè)CYP2C9的蛋白表達(dá)水平: RIPA裂解液收集293T-MigR1、293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27細(xì)胞全蛋白。以20 μg的蛋白量上樣于10%SDS-PAGE凝膠并電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上, 5%脫脂奶粉封閉，分別與CYP2C9抗體(1︰5 000稀釋)或β-actin抗體(1︰1 000稀釋)于4 ℃孵育過夜，TBST洗3次后與HRP-山羊抗兔抗體(1︰5 000稀釋)或HRP-山羊抗小鼠抗體(1︰5 000稀釋)室溫孵育1 h, TBST洗3次, ECL顯色，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像(Tanon 5500)。

1.4.3CYP2C9活性檢測(cè): 分別培養(yǎng)293T-MigR1、293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27至對(duì)數(shù)生長期并用細(xì)胞刮刀收集全部細(xì)胞并重懸于含0.15 mol/L KCl 的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH值7.4), 70W功率下超聲破碎細(xì)胞，于9 000×g離心20 min, 收集上清后100 000×g離心1 h, 獲得沉淀重懸于100 mmol/L磷酸緩沖液(pH 值7.4), 即為細(xì)胞的微粒體懸液。人肝微粒體的制備方法見參考文獻(xiàn)[15]。分別上述取微粒體(0.5 mg/mL)與氯化鎂(MgCl2)(5 mmol/L), 雙氯芬酸鈉(100 μmol/L)及NADPH(10 μmol/L)混合, 37 ℃水浴30 min后加入甲醇終止反應(yīng)。采用LC/MS/MS檢測(cè)代謝產(chǎn)物4-羥基雙氯芬酸[14]。

2　結(jié)　果

2.1　重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

來自人肝組織的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后，獲得產(chǎn)物大小在1 500 bp左右。通過重疊PCR法獲得產(chǎn)物大小也約為1 500 bp，與預(yù)期CYP2C9編碼序列一致。上述片段分別插入MigR1質(zhì)粒后，重組獲得的MigR1-CYP2C9、MigR1-CYP2C9*8與MigR1-CYP2C9*27質(zhì)粒分別經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切，得到與預(yù)期片段相符約6 000 bp的載體片段和約1 400 bp的目的片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果利用NCBI中的Blast工具與CYP2C9進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明449G>A (CYP2C9*8)與449G>T(CYP2C9*27)突變成功(圖2), 序列中無其他突變。

M：DNAmarkerDL5000；1：MigR1?CYP2C9雙酶切產(chǎn)物；2：MigR1?CYP2C9?8雙酶切產(chǎn)物；3：MigR1?CYP2C9?27雙酶切產(chǎn)物；4：MigR1雙酶切產(chǎn)物；5：MigR1質(zhì)粒圖1　重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

圖2　重組質(zhì)粒MigR1?CYP2C9(A)、MigR1?CYP2C9?8(B)與MigR1?CYP2C9?27(C)測(cè)序結(jié)果

2.2　綠色熒光蛋白的表達(dá)情況

細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)30代后，在熒光顯微鏡下觀察可以看到293T-2C9、293T-2C9*8、293T-2C9*27與293T-MigR1細(xì)胞均有明顯的綠色熒光，而未感染的293T細(xì)胞未見綠色熒光(圖3)。

2.3　qRT-PCR檢測(cè)CYP2C9 mRNA水平

細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)30代后，提取293T-MigR1、293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27胞內(nèi)的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，采用qRT-PCR方法，檢測(cè)胞內(nèi)的CYP2C9 mRNA表達(dá)水平。與空質(zhì)粒對(duì)照組(293T-MigR1)比較, 293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27胞內(nèi)的mRNA高水平明表達(dá)(圖4)。

2.4　Western blot檢測(cè)CYP2C9蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)30代后，提取293T-MigR1、293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27細(xì)胞總蛋白。Western blot結(jié)果顯示, 293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27細(xì)胞株及陽性對(duì)照(肝組織裂解液)在53kD附近可見特異性條帶，而空質(zhì)粒對(duì)照(293T-MigR1)組未見條帶(圖5)。

左圖為明場(chǎng)圖像，右圖為熒光圖像。圖3　HEK293T(A)、293T?MigR1(B)、293T?2C9(C)、293T?2C9?8(D)、293T?2C9?27(E)與細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)30代后，細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光水平。

???P<0．001；??P<0．01。圖4　293T?MigR1、293T?2C9、293T?2C9?8與293T?2C9?27細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)30代后，細(xì)胞內(nèi)CYP2C9mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

圖5　Westernblot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)CYP2C9蛋白的表達(dá)水平

2.5　CYP2C9活性檢測(cè)

提取細(xì)胞微粒體，采用特異性探針底物雙氯芬酸對(duì)CYP2C9的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。雙氯芬酸與微粒體在NADPH存在條件下分別孵育后，檢測(cè)4-羥基雙氯芬酸的生成速率。結(jié)果表明，采用Western blot蛋白相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果后, 293T-2C9、293T-2C9*8與293T-2C9*27的微粒體均有催化雙氯芬酸代謝為4-羥基雙氯芬酸代謝的活性，而且催化活性為CYP2C9與CYP2C9*27接近，而CYP2C9*8的催化活性較弱(圖6)。

圖6　293T?2C9、293T?2C9?8與293T?2C9?27細(xì)胞微粒體催化雙氯芬酸生成4?羥基雙氯芬酸的相對(duì)生成速率

3　討　論

CYP2C9*8(R150H)與CYP2C9*27(R150L)雖然為同位點(diǎn)的突變，但其對(duì)底物代謝清除速率的影響因底物而異[7-11]。因此評(píng)價(jià)不同藥物代謝速率所受的影響對(duì)預(yù)測(cè)血藥濃度和預(yù)防藥物不良反十分必要[16]。盡管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究可以直接反映基因多態(tài)性對(duì)藥物的血藥濃度的影響，但由于突變體出現(xiàn)頻率較低和直接人體實(shí)驗(yàn)的存在安全風(fēng)險(xiǎn)[17]等原因，重組表達(dá)突變體并進(jìn)行體外酶活性評(píng)價(jià)是可行的替代方法[18-19]。CYPs為膜蛋白，在大腸桿菌中表達(dá)后常與二月桂?；蚜字?DLPC)重構(gòu)[20-23]。桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞體系也是常見的CYPs表達(dá)體系[24-26]。上述系統(tǒng)中磷脂成分與人膜磷脂成分存在差異，這些差異對(duì)CYPs的活性的影響也影響體外模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性[27-28]。體外研究中，應(yīng)用昆蟲Sf21、非洲綠猴COS-7與人HepG2細(xì)胞所表達(dá)CYP2C9*2突變體，在研究該突變對(duì)甲苯磺丁脲的代謝影響中得到了相反的結(jié)論。本研究采用人源HEK293細(xì)胞表達(dá)CYP2C9及其突變體，可極大降低表達(dá)體系的種屬差異在代謝酶活性研究存在的潛在影響。

本研究采用了慢病毒包裝質(zhì)粒后感染HEK2C9T細(xì)胞，其效率明顯高于使用脂質(zhì)體直接轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，有效提高了流式分選和單克隆篩選的效率。獲得的單克隆細(xì)胞在傳代30代后仍保持100%綠色熒光，可穩(wěn)定表達(dá)外源基因。qRT-PCR與Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果這表明目標(biāo)蛋白在HEK293T細(xì)胞中高表達(dá)。

以雙氯芬酸為底物研究表明, CYP2C9*8催化生成4-羥基雙氯芬酸的速率低于野生型CYP2C9, 該結(jié)果與人體內(nèi)結(jié)果相符[29], 表明該穩(wěn)定表達(dá)CYP2C9*8的細(xì)胞模型可適合體內(nèi)代謝情況的預(yù)測(cè)研究。CYP2C9特異性底物甲苯磺丁脲的體內(nèi)研究表明, CYP2C9*27突變并不顯著影響甲苯磺丁脲的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為[30]。本研究構(gòu)建的CYP2C9*27與野生型CYP2C9的代謝速率相近，該結(jié)果與體內(nèi)結(jié)論相似。表明本研究構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)體系適用于CYP2C9*8與CYP2C9*27兩個(gè)突變體的研究。

綜上所述，本研究成功建立一種穩(wěn)定表達(dá)CYP2C9、CYP2C9*8與CYP2C9*27的細(xì)胞模型，為CYP2C9蛋白150位的常見突變體的代謝能力的預(yù)測(cè)和CYP2C9底物的藥物的安全用藥提供理論依據(jù)。

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