維生素D受體遺傳變異與急性腦卒中的關(guān)聯(lián)

鄒王軍, 陸敏艷, 孫　凱

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院, 1. 急診科; 2. 神經(jīng)內(nèi)科, 江蘇 蘇州, 215228)

急性腦卒中是急診常見病癥之一，其具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率以及高醫(yī)療負(fù)擔(dān)的特點(diǎn)[1]。腦卒中作為一個全球性的健康問題，是影響傷殘調(diào)整壽命年第3位的原因。腦卒中造成的死亡和殘疾為發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。腦卒中主要分為出血型和缺血型兩大類，臨床以缺血型腦卒中最為多見，其發(fā)病機(jī)制是極其復(fù)雜的，從遺傳學(xué)角度分析，腦卒中為一組多基因遺傳性疾病，僅少數(shù)腦卒中是由單基因遺傳缺陷所引起[2]。心臟和衰老基因組流行病學(xué)隊(duì)列研究協(xié)作組(CHARGE)開展了一項(xiàng)目前最大規(guī)模的腦卒中全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)，此項(xiàng)研究結(jié)果揭示除一些不明危險(xiǎn)因素外，遺傳因素可能是腦卒中發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素[3]。研究[4]已證實(shí)，缺乏維生素D可增加腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。維生素D與維生素D受體(VDR)相結(jié)合后才能發(fā)揮生物學(xué)功能。VDR遺傳變異與多種心腦血管疾病均有不同程度的關(guān)聯(lián)，Prabhakar P等[5]在印度人群中發(fā)現(xiàn)，VDR基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性與缺血型腦卒中的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。目前，在我國漢族人群中尚未開展VDR基因遺傳多態(tài)與缺血型腦卒中關(guān)聯(lián)的研究。本研究結(jié)合國外已有的研究進(jìn)展，采用基于醫(yī)院的病例對照研究，探討VDR基因遺傳多態(tài)與缺血型腦卒中發(fā)病的關(guān)聯(lián)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1　一般資料

隨機(jī)選取2014年5月—2017年5月在江蘇盛澤醫(yī)院急診收治且診斷為急性缺血型腦卒中患者263例為急性缺血型腦卒中組。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 所有病例均經(jīng)過CT/MRI以及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查明確診斷; ② 年齡18～70歲; ③ 自愿作為研究對象，保證完成研究過程。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 其他心血管疾病患者; ② 年齡在18歲以下或70歲以上; ③ 合并感染性疾病、腫瘤患者。所有研究均為無血緣關(guān)系的人群，且排除孕婦、哺乳婦女者。健康對照組為本單位同時(shí)期參加體檢的健康人群591例，按照年齡、性別等因素與口腔癌組相匹配。本研究獲得了本單位倫理委員會的批準(zhǔn)，且嚴(yán)格遵守倫理學(xué)的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2　調(diào)查方法

參照相關(guān)文獻(xiàn)自行設(shè)計(jì)《腦卒中患者調(diào)查表》進(jìn)行現(xiàn)場詢問調(diào)查，在研究對象知情同意的前體下由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查人員對研究對象進(jìn)行詢問調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括基本情況(年齡、性別、吸煙、飲酒等)，既往疾病史(慢性疾病史、傳染病史、其他腫瘤史等)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

經(jīng)知情同意后，抽取研究對象EDTA抗凝靜脈血5 mL, 并在24 h內(nèi)以4 000轉(zhuǎn)離心10 min, 將靜脈血分離成血清層、白細(xì)胞層和紅細(xì)胞層，分裝于1.5 mL凍存管，置-20 ℃貯存。血清25(OH)D3水平的檢測采用ELISA法，試劑盒購自南京百斯凱科技有限公司。所有實(shí)驗(yàn)的具體操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。從NCBI、HapMap等數(shù)據(jù)庫中尋找和確認(rèn)VDR基因的SNPs位點(diǎn)，選擇在中國人群具有較高頻率(MAF≥5%), 再結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，最終確定了FokI和ApaI兩個位點(diǎn)。運(yùn)用ABI公司設(shè)計(jì)的TaqMan-MGB熒光探針實(shí)時(shí)定量PCR法檢測FokI和ApaI位點(diǎn)基因型。探針和引物均委托南京驥驁生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)。反應(yīng)在ABI 7900 PCR儀中進(jìn)行，采用SDS2.3軟件讀取檢測數(shù)據(jù)。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用EpiData 3.10、SAS 9.1.3、SPSS17.0和PHASE 2.0軟件對調(diào)查和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，健康對照在和病例組中性別、吸煙、飲酒分布情況采用卡方檢驗(yàn)，年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)分布差異采用t檢驗(yàn)，血清25(OH)D3水平分布不符合正態(tài)分布，故采用秩和檢驗(yàn)方法。VDR基因位點(diǎn)在人群中分采用多因素Logistic回歸分析。本研究的檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1　研究對象的一般情況

本研究共納入263例急性腦卒中患者和591例健康對照者。2組人群在性別和年齡分布上無顯著差異(P=0.07、0.28), 2組人群中吸煙和飲酒人數(shù)的分布亦無顯著差異(P=0.09、0.84)。血清25(OH)D3水平在健康對照組中的分布顯著高于急性腦卒中組(P<0.01)。見表1。

表1　急性腦卒中組與健康對照組一般情況的比較

與健康對照組比較, **P<0.01。

2.2　VDR基因多態(tài)性與急性腦卒中遺傳易感性的關(guān)系

多因素Logistic回歸分析顯示，在調(diào)整年齡、BMI等因素后，與FF基因型相比, FokI位點(diǎn)的Ff可以顯著增加個體急性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整OR=1.65，95% CI=1.18～2.32); 作者并沒有發(fā)現(xiàn)ApaI位點(diǎn)多態(tài)性與急性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在顯著關(guān)聯(lián)。顯性模型顯示，與FF基因型相比，F(xiàn)okI位點(diǎn)的變異基因型Ff/ff可以顯著增加急性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(調(diào)整OR=1.61, 95%CI=1.16～2.21), 而ApaI位點(diǎn)Aa/aa基因型與AA相比，并未發(fā)現(xiàn)該基因型與急性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)(調(diào)整OR=1.17, 95%CI=0.87～1.57)。見表2。

表2　VDR基因多態(tài)性與急性腦卒中遺傳易感性的關(guān)系[n(%)]

調(diào)整因素分別為年齡、BMI、性別、吸煙和飲酒

2.3　單倍型研究

與fa單倍型相比, Fa單倍型在急性腦卒中組的分布顯著低于健康對照組(調(diào)整OR=0.66, 95%CI=0.51～0.85), 見表3。

表3　VDR基因SNP位點(diǎn)單倍型分析與急性腦卒中發(fā)病的關(guān)聯(lián)[n(%)]

調(diào)整因素分別為年齡、BMI、性別、吸煙和飲酒

3　討　論

維生素D是參與機(jī)體多種生理反應(yīng)、免疫功能的類固醇類衍生物。25(OH)D3是機(jī)體維生素D最重要的活性代謝產(chǎn)物，可參與抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS), 起到降低血壓，保護(hù)血管的作用[6]。本研究中，健康對照組的血清25(OH)D3水平顯著高于急性腦卒中組，這與苗偉等[7]的研究結(jié)果相同，表明機(jī)體血清25(OH)D3水平確與急性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，且急性腦卒中患者普遍存在缺乏維生素D的現(xiàn)象，這對急性腦卒中的臨床診斷具有一定的指導(dǎo)意義。

維生素D發(fā)揮生物學(xué)功能依賴與VDR的結(jié)合，而VDR的表達(dá)受控于VDR基因多態(tài)性。因此，VDR基因多態(tài)性可通過影響VDR的表達(dá)而調(diào)控維生素D的生物學(xué)功能。人類VDR基因位于染色體12q13～14, 其cDNA全長約100 kb, 由多個內(nèi)含子和9個外顯子組成。VDR基因多態(tài)性與多種疾病發(fā)生均有關(guān)聯(lián)，包括免疫學(xué)疾病、慢性疾病、感染性疾病以及腫瘤等[8]。Saadi A等[9]在一項(xiàng)基于漢族人群的病例對照研究中發(fā)現(xiàn), FokI和BsmI位點(diǎn)多態(tài)性與哮喘的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。同樣在漢族人群總，盛正妍等[10]研究發(fā)現(xiàn)FokI位點(diǎn)多態(tài)性與Ⅰ型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。在一項(xiàng)Meta分析研究中, Gao等[11]發(fā)現(xiàn)FokI位點(diǎn)ff基因型可增加亞洲人群結(jié)核的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。由此可見, VDR基因FokI位點(diǎn)確實(shí)與多種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。本研究中，作者發(fā)現(xiàn)FokI位點(diǎn)的Ff可以顯著增加個體急性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，其變異基因型Ff/ff亦可顯著增加急性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。然而，未發(fā)現(xiàn)ApaI位點(diǎn)多態(tài)性與急性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。在單倍型研究中，作者發(fā)現(xiàn)與fa單倍型相比, Fa單倍型在急性腦卒中組的分布顯著低于健康對照組，由此可見, FokI位點(diǎn)多態(tài)性在VDR基因變異中發(fā)揮著重要作用，且這種作用在一定條件下起到主導(dǎo)作用。印度學(xué)者Puttachandra等[5]首次研究了VDR基因FokI、ApaI、TaqI以及BsmI四個位點(diǎn)多態(tài)性與急性缺血型腦卒中患者發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)FokI位點(diǎn)多態(tài)性與急性缺血型腦卒中患者的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果與本研究一致。有研究發(fā)現(xiàn), FokI位點(diǎn)多態(tài)性與缺血性卒中患者膽固醇水平有關(guān)。眾所周知，血脂異常是腦卒中的重要危險(xiǎn)因素。因此, VDR基因多態(tài)性可能通過影響機(jī)體血脂水平，來間接影響腦卒中的發(fā)病。

綜上所述，維生素D水平以及VDR基因多態(tài)性對急性腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的作用不可忽視，其可預(yù)測急性腦卒中的發(fā)病以及影響急性腦卒中發(fā)生、發(fā)展的臨床結(jié)局。

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