巨噬細(xì)胞來源的外泌體不同提取方法的比較

王飄飄，王會會，彭代銀,3，張善堂，陳衛(wèi)東,3

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥　230011；2. 安徽省立醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥　230001；3．安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥　230031)

外泌體(exosomes，EXOs)是由大多數(shù)細(xì)胞分泌的納米級(30-150 nm)囊泡，如上皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均可分泌EXOs[1]?？梢愿鶕?jù)粒徑大小、囊泡攜帶的內(nèi)容物及其在體內(nèi)的去向來區(qū)別EXOs和其他囊泡[2]。因?yàn)槠渌哪遗?，比如微囊泡的形成方式是?xì)胞表面出芽，而EXOs通常被認(rèn)為起源于細(xì)胞內(nèi)的多泡小體，然后多泡小體和細(xì)胞質(zhì)膜融合而釋放EXOs[3]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括凋亡小體、微囊泡(microvesicles，MVs)和EXOs在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡，并已成為正常生理和病理狀況下細(xì)胞間通訊的重要參與者[4]。而EXOs攜帶的蛋白質(zhì)、核酸則是細(xì)胞間信號傳導(dǎo)和信息交流的載體[5]。巨噬細(xì)胞(macrophage，MΦ)是抗原呈遞細(xì)胞家族中一種重要的免疫細(xì)胞，可遞呈抗原到自身表面的MHC分子，抗原-MHC復(fù)合物通過和T細(xì)胞受體(T cell reporter，TCR)相互作用，引起T細(xì)胞的活化。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，來源MΦ的EXOs表面同樣表達(dá)MHCs及相應(yīng)的復(fù)合物，活化T細(xì)胞而獲得免疫反應(yīng)[6]。

EXOs因其獨(dú)特的生理作用而引起研究者的廣泛關(guān)注。然而，囊泡亞群并沒有完全明確的定義，并且有些囊泡在大小和密度上可能重疊，這使得一般的方法難以將其提取分離出來[7]。而且，EXOs所攜帶的物質(zhì)及其機(jī)制仍然存在很大的爭議[3]，想得到完全純的囊泡幾乎不可能。另外，EXOs的提取和純化需要大量的物力和財(cái)力，特別是研究EXOs蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)。最近出現(xiàn)了使用方便、價(jià)格昂貴的商品化試劑盒，如產(chǎn)自Systems Biosciences的ExoQuickTM和產(chǎn)自Life Technologies 的Toal Exosome IsolationTM，盡管目前這些試劑盒被廣泛使用，但是研究者發(fā)現(xiàn)該試劑盒提取得到的EXOs的產(chǎn)量和質(zhì)量卻不及其他方法。

ExoQuick和Toal Exosome Isolation的主要成分是一些聚合物(如聚乙二醇或者乙烯類聚合物)。簡單的溶解聚乙二醇(PEG)來提取分離病毒和其他生物大分子已有50多年歷史[8]。因?yàn)镋XOs和病毒有著類似的生物學(xué)和物理學(xué)性質(zhì)，假設(shè)用PEG沉淀的方法先將EXOs沉淀出來，再結(jié)合超高速離心除去雜質(zhì)蛋白，從而找到可以替代超高速離心和試劑盒的一種便宜可行的EXOs分離方法?；贏lbertsson等[8]使用的PEG濃縮病毒的方法來提取分離EXOs，為了驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性，將PEG沉淀結(jié)合超高速離心收集的EXOs和其他方法得到的EXOs進(jìn)行對比。通過檢測EXOs的形態(tài)、粒徑及蛋白表達(dá)情況，改進(jìn)方法的可行性。

1　材料

1.1細(xì)胞小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7由復(fù)旦大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2試劑RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素購自Hyclone；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自Gibco；BCA蛋白試劑盒購自碧云天公司；超敏感發(fā)光試劑盒購于Thermo公司；兔單克隆抗體Alix、TSG101、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，均購自英國Abcam公司；PEG6000、氯化鈉均購自Sigma公司。

1.3儀器Tecnai G2 SpirtBiotwin生物性透射電鏡(美國賽默飛世爾公司)；L-90K超高速低溫離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；納米粒度儀NanoSight ZEN3690(英國馬爾文公司)。

2　方法

Fig 1　The transmission electron microscopy of exosomes isolated from culture medium by ultra-high speed centrifugation (A), EXO Quick kit (B), polyethylene glycol 6000 precipitation(C)

2.1巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)用含有10% FBS(無EXOs)、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，待細(xì)胞融合到85%左右時(shí)，收集細(xì)胞上清，將細(xì)胞正常傳代。

2.2細(xì)胞EXOs的提取

2.2.1超高速離心法將收集到的細(xì)胞上清液約200 mL，分裝在離心管中，4℃ 2 000×g離心10 min，10 000×g離心30 min除去細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，于120 000×g離心70 min(4℃)，收集試管底部液體，加入PBS重懸，然后再4℃、120 000×g離心70 min，得到的沉淀就是EXOs(D-EXOs)。將沉淀用PBS重懸，-80℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2ExoQuick試劑盒用購自美國System Biosciences(SBI)公司的EXOs提取試劑盒，具體步驟按照試劑盒說明書。將收集到的細(xì)胞上清液4℃、2 000×g離心10 min，10 000×g離心30 min除去細(xì)胞碎片，然后將上清與試劑盒按照體積比5 ∶1混合，4℃靜置過夜，15 000×g離心30 min(4℃)，將得到的沉淀(S-EXOs)用PBS重懸，-80℃保存。

2.2.3PEG6000改進(jìn)的PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心法富集EXOs的具體步驟如下：將16 g PEG6000、5.18 g NaCl溶于100 mL超純水，配制成16%的儲備液。過0.45 μm濾膜后備用。將收集到的細(xì)胞上清液約200 mL，4℃、2 000×g離心10 min，10 000×g離心30 min除去細(xì)胞碎片，上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，收集的上清液與等體積的PEG6000儲備液混合，上下顛倒混勻，于4℃冰箱靜置過夜(12 h以上)；10 000×g離心60 min(4℃)；棄去上清，沉淀用PBS重懸，120 000×g離心90 min(4℃)，收集的沉淀即為EXOs(P-EXOs)，用PBS重懸后，于-80℃冰箱保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3生物型透射電子顯微鏡(TEM)觀察EXOs的形態(tài)分別取超高速離心法、PEG6000沉淀法和試劑盒法提取的EXOs 20 μL，將EXOs滴加至銅網(wǎng)上，1 min后用濾紙吸干，再加1滴1%醋酸氧鈾1 min后，用濾紙吸干，置于白熾燈下烤干，于電子透射顯微鏡下觀察，并拍照。

2.4動態(tài)光散射(dynamiclightscattering，DLS)測定EXOs的粒徑取0.5 mL EXOs母液，4.5 mL超純水稀釋，過0.22 μm的濾膜后，用納米粒度儀對其粒徑進(jìn)行檢測。

2.5納米粒子示蹤技術(shù)(nanoparticletraceranalysis，NTA)測定EXOs的粒徑分布和濃度該技術(shù)可以實(shí)時(shí)直接通過光學(xué)顯微鏡收集觀測納米顆粒的散射光信號，然后對其在溶液中的布朗運(yùn)動進(jìn)行拍攝，最后對每個(gè)布朗運(yùn)動的粒子進(jìn)行追蹤及分析，快速準(zhǔn)確地計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)半徑及濃度[9]。取EXOs母液，用水按照1 ∶7 500比例稀釋到10 mL，設(shè)置儀器參數(shù)進(jìn)樣，計(jì)算出細(xì)胞上清液中EXOs的濃度。

2.6Westernblot分析EXOs的特異性蛋白將分離純化的EXOs加上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，冷卻至室溫，12% SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1.5 h，分別加入兔抗鼠TSG101單克隆抗體(1 ∶1 000)、兔抗鼠Alix單克隆抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)2 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL超敏發(fā)光試劑盒檢測。

3　結(jié)果

3.13種方法得到的EXOs的形態(tài)透射電鏡下觀察3種方法得到的EXOs，F(xiàn)ig 1結(jié)果表明，3種方法提取分離得到的EXOs的粒徑大小均在100 nm左右，符合文獻(xiàn)報(bào)道的30～150 nm。染色后可以看到EXOs包膜完整，呈典型的杯狀結(jié)構(gòu)。

3.2EXOs的粒徑分布Fig 2 中1號曲線是差速離心法得到的EXOs，其平均粒徑為82.01 nm(PDI=0.592)，2號曲線是ExoQuick試劑盒法得到的EXOs，粒徑的平均值為130.9 nm(PDI=0.847)，3號曲線是PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心法得到的EXOs，粒徑均值為78.4 nm(PDI=0.224)。從粒徑分析，PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心得到的EXOs的平均粒徑最小，Exo Quick試劑盒法得到的EXOs的粒徑最大，但是差速離心法得到的EXOs粒徑集中分散在82 nm附近，另外兩種方法得到的EXOs粒徑范圍較大，但均在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍內(nèi)。結(jié)果提示，采用PEG沉淀結(jié)合超高速離心法得到的EXOs含有較少的其他大囊泡和雜質(zhì)蛋白。

Fig 2　The particle size distribution of exosomes isolated byultra-high speed centrifugation (A), EXO Quick kit (B), polyethylene glycol 6000 precipitation (C)

3.3外泌體的濃度和粒徑分布將3種方法提取的EXOs經(jīng)PBS稀釋7 500倍，測得差速離心法得到的EXOs的濃度大約為5.6×1014·L-1，試劑盒提取得到的EXOs的濃度大約為8.2×1015·L-1，PEG沉淀結(jié)合超高速離心的EXOs濃度約為8.6×1015·L-1(Fig 3)。

Fig 3　Concentration of exosomes isolated by Ultra-high speed centrifugation (A), EXO Quick kit (B), polyethylene glycol 6000 precipitation(C)

3.4蛋白檢測結(jié)果蛋白印跡結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了3種方法均提取得到了EXOs(Fig 4)，Alix和TSG101在MΦ及其EXOs中均有表達(dá)，但是在EXOs中的表達(dá)豐度高于MΦ。

Fig 4　Expression of exosome surface marker of Alix and TSG101 isolated by ultra-high speed centrifugation, EXO Quick kit, polyethylene glycol 6000 precipitation

4　討論

EXOs是內(nèi)源性的囊泡，可用于診斷和治療腫瘤等相關(guān)疾病[10]。MΦ是抗原呈遞家族細(xì)胞之一，其在腫瘤和炎癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色。M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的EXOs可以通過創(chuàng)建淋巴結(jié)的炎性環(huán)境，來增強(qiáng)抗腫瘤疫苗的活性[11]，在缺氧環(huán)境下，巨噬細(xì)胞來源的EXOs誘發(fā)內(nèi)皮炎癥因子的表達(dá)[12]。在心臟損傷過程中，巨噬細(xì)胞來源的EXOs攜帶mir-155，抑制纖維細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其炎癥的產(chǎn)生[13]。正常巨噬細(xì)胞來源的EXOs攜帶較高水平的IL-6和IL-8，進(jìn)入胎盤后，影響胎盤對炎癥刺激的免疫調(diào)節(jié)能力[14]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞來源EXOs在腫瘤和炎癥反應(yīng)中的重要作用，為進(jìn)一步探討巨噬細(xì)胞EXOs的其他生理功能，建立一種高效分離細(xì)胞EXOs的方法變得尤為重要。

現(xiàn)在EXOs分離提取常用的方法有經(jīng)典的超高速離心法、試劑盒法、免疫磁珠法、親和層析法、PEG沉淀法等。超高速離心法需要較長時(shí)間，試劑盒價(jià)格昂貴，各方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，而EXOs質(zhì)量和產(chǎn)量是后續(xù)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。Rider等[15]2016年發(fā)表的文章中對比了5%～10%及12%的7種PEG6000濃度提取細(xì)胞上清EXOs的總蛋白及RNA的數(shù)量和質(zhì)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8%的PEG6000得到的EXOs的純度和傳統(tǒng)的差速離心法相近，后續(xù)共聚焦實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PEG6000沉淀得到的EXOs的生物學(xué)功能不會受到影響，但是單純的PEG6000沉淀下來的會有很多雜質(zhì)蛋白，PEG也會部分黏附在EXOs表面，得到的EXOs不純且粒徑較大。

8% PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心富集細(xì)胞上清中的EXOs，為了得到純度更高的EXOs，將得到的沉淀用PBS重懸，超高速離心100 000×g離心90 min，通過TEM、DLS及NTA對提取物的形態(tài)和大小分布情況進(jìn)行檢測。TEM結(jié)果顯示，PEG6000結(jié)合超高速離心法和差速離心法得到的EXOs在溶液中分散性較好，沒有大量的聚集，而試劑盒法得到的EXOs則有明顯的聚集，但是3種方法均得到了杯狀或不規(guī)則形狀的納米級囊泡，直徑符合文獻(xiàn)報(bào)道的30～150 nm之間。DLS的結(jié)果顯示，PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心的EXOs的粒徑較小，但是DLS沒有NTA較高的分辨率，也無法計(jì)算粒子的濃度，所以我們用NTA對EXOs進(jìn)行進(jìn)一步的表征。NTA結(jié)果顯示，3種方法得到的EXOs的粒徑在100 nm左右，含有部分尺寸較大的囊泡，較大尺寸的囊泡可能由于EXOs的聚集所致，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果也是相符的。PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心法和試劑盒得到的EXOs的濃度相當(dāng)，差速離心法的濃度略小一些。結(jié)合EXOs的表面穩(wěn)定表達(dá)的抗原呈遞蛋白，檢測了提取物中Alix和Tsg101表達(dá)情況，結(jié)果顯示，提取物均陽性表達(dá)這2種蛋白，結(jié)果可以再次證明PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心提取細(xì)胞來源的EXOs的可靠性。

綜上，改進(jìn)的8% PEG6000沉淀結(jié)合超高速離心的方法可以準(zhǔn)確、快速、高效地提取分離出細(xì)胞上清中的EXOs，為后續(xù)研究探討MΦ來源的EXOs在腫瘤和炎癥方面的生物學(xué)功能及相關(guān)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為MΦ來源的EXOs在臨床醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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