雙龍方對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注后無(wú)復(fù)流影響的研究

李峰杰，李貽奎，何　萍，郝新梅，李超華，趙　樂(lè)，郝　偉，余丞浩，張金艷

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100091)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)及溶栓治療是目前急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)最重要的再灌注治療方法。然而臨床發(fā)現(xiàn)，AMI經(jīng)溶栓或PCI治療后，大于30%的患者可發(fā)生無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，表現(xiàn)為心肌微循環(huán)水平血流受限，冠狀動(dòng)脈造影顯示為冠狀動(dòng)脈血流明顯減慢、心電圖ST段回落不良以及臨床持續(xù)性胸痛[1]。對(duì)無(wú)復(fù)流的防治尚無(wú)理想的標(biāo)準(zhǔn)治療措施，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外陸續(xù)嘗試了包括血栓保護(hù)裝置和血栓抽吸裝置等器械防治和西藥干預(yù)的手段。但是，研究顯示應(yīng)用保護(hù)裝置的患者并未獲得血流和臨床死亡率方面的益處[2]。同時(shí)，由于心肌組織無(wú)復(fù)流諸多病理因素，而這些西藥均針對(duì)某個(gè)病理環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，因此療效一般、作用有限。近年來(lái)陸續(xù)開(kāi)展了中藥防治無(wú)復(fù)流的實(shí)驗(yàn)研究和小樣本臨床觀察[3-4]。但是，目前對(duì)中醫(yī)藥防治無(wú)復(fù)流的研究還非常有限。

雙龍方(shuanglong formula,SLF)是李連達(dá)院士的臨床經(jīng)驗(yàn)方，由人參和丹參兩味中藥組成，方中丹參活血化瘀，人參補(bǔ)氣養(yǎng)血，兩者協(xié)同共奏益氣活血之功效，主治冠心病心絞痛和心肌梗死，療效肯定。20世紀(jì)80年代起，本課題組就開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行組方、配伍和提取工藝的優(yōu)化研究[5]，并通過(guò)大鼠和小型豬急性心肌缺血等實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其對(duì)急性心肌缺血確有明顯療效[6-7]。從中醫(yī)理論來(lái)分析，“心主血脈”，全身血脈的正常運(yùn)行，全靠心氣的推動(dòng)，而再灌注后的無(wú)復(fù)流，是心肌微循環(huán)障礙的表現(xiàn)，應(yīng)屬心絡(luò)受損，血瘀絡(luò)阻。因此從理論上推測(cè)，具有益氣活血功效的雙龍方對(duì)無(wú)復(fù)流理應(yīng)具有一定的防治作用?；诖?，本項(xiàng)目擬就雙龍方對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注后無(wú)復(fù)流的影響及其機(jī)制進(jìn)行探討。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑雙龍保心片(薄膜衣片)，廣州香雪制藥有限公司，批號(hào)：20141002；氯化硝基四氮唑藍(lán)(N-BT)，批號(hào)2541C012，Amresco公司；水合氯醛，批號(hào)20110509，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫磺素S，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)SLBG4212V；注射用六氟化硫微泡，Bracco Suisse SA公司，批號(hào)：16A039；大鼠血清肌鈣蛋白(cardiac troponin T，cTnT)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)ELISA試劑盒，北京方程嘉鴻科技有限公司，批號(hào)：201706。

1.2儀器DT-2000型電子天平，美國(guó)雙杰兄弟有限公司；MPIDS-500多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)，北京空海公司；Vevo 770高分辨小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)，加拿大 Visual sonics Inc；光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica公司；DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶標(biāo)儀，芬蘭Thermo公司；Thermo Scientific IEC CL31R離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組健康Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量200～220 g，200只，由斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技股份有限公司提供。許可證編號(hào)：SCXK京2016-0002。將200只大鼠隨機(jī)分為5組，每組40只：模型組、假手術(shù)組、雙龍方5g生藥/kg組、雙龍方2.5g生藥/kg組、雙龍方1.25g生藥/kg組。

1.4造模及給藥各組大鼠在造模前按照10 mL·kg-1灌胃給藥，每天1次，連續(xù)5 d，模型組和假手術(shù)組灌胃同體積蒸餾水。給藥結(jié)束后，大鼠以10 mL·kg-1腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉，仰臥固定于大鼠板上。在大鼠左側(cè)第4、5肋間切口，打開(kāi)胸腔，撕開(kāi)心包，輕壓胸廓擠出心臟，于左心耳下2 mm的冠狀動(dòng)脈左前降支下穿線，血管與結(jié)扎線之間墊一長(zhǎng)約0.5～1 cm的軟硅膠管，用0號(hào)手術(shù)線結(jié)扎冠脈，立即將心臟放回胸腔，以動(dòng)脈夾夾閉切口，假手術(shù)動(dòng)物只穿線不結(jié)扎。結(jié)扎后4 h，剪斷硅膠管，實(shí)施再灌注。

1.5指標(biāo)測(cè)定再灌注4 h后，麻醉大鼠，測(cè)定如下指標(biāo)。

1.5.1心功能指標(biāo)采用Vevo 770小動(dòng)物高分辨率超聲影像系統(tǒng)，選用RMV-716探頭，在17.5 MHz的頻率下，行超聲心動(dòng)圖檢查。受檢大鼠于左側(cè)胸骨旁獲取左室乳頭肌水平短軸切面，測(cè)量左心室舒張末期前壁厚度與后壁厚度、舒張末期和收縮末期左室內(nèi)徑，左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax)和最大下降速率(dp/dtmin)，左心室收縮末期壓和舒張末期壓，計(jì)算舒張末期和收縮末期左室容積、射血分?jǐn)?shù)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、每搏輸出量(stroke volume，SV)。所有超聲測(cè)值均取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

1.5.2心肌聲學(xué)造影按照每只0.8 mL的給藥體積，在5 s內(nèi)尾靜脈勻速注射11.8 g·L-1聲諾維注射液。將感興趣區(qū)置于左心室前壁灌注異常區(qū)，從注射造影劑前5 s開(kāi)始記錄造影劑在心肌灌注的視頻(共16 s)，使用ACQ軟件，得到造影顯像的時(shí)間-強(qiáng)度曲線及其擬合函數(shù)：Y=A(1-e-βt)+C。讀出微血管密度(A，dB)，局部血流速度(β，s-1)，計(jì)算局部心肌灌注量(A·β)。

1.5.3血液學(xué)指標(biāo)超聲檢查結(jié)束后，于股動(dòng)脈注射6%硫磺素S 1 mL·kg-1，1 min后，于腹主動(dòng)脈取血，分離血清。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定血清cTnT、CRP、CK、LDH水平。

1.5.4心肌無(wú)復(fù)流面積大鼠取血完畢后，立即處死，取出心臟，用生理鹽水沖洗心腔殘留的血液，用濾紙吸干多余液體后稱重；自結(jié)扎線下平行冠狀動(dòng)脈溝均勻地將心室部分切成等厚5片，分別稱重后，將心臟切片置于薄層色譜儀的暗箱中，于365 nm波長(zhǎng)光源下，觀察熒光，數(shù)碼相機(jī)拍照，分別獲得5片心肌的正、反面圖像，用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每片心肌雙側(cè)的無(wú)復(fù)流區(qū)(硫磺素不著色，呈暗黑色)和復(fù)流區(qū)(硫磺素著色，呈明亮的藍(lán)綠色)，計(jì)算無(wú)復(fù)流區(qū)占心室面積百分比(AN/V)和無(wú)復(fù)流區(qū)占全心面積百分比(AN/WH)。

1.5.5心肌梗死面積上述處理結(jié)束后，將心臟切片置于0.2%硝基四氮唑藍(lán)染液(N-BT)中，常溫避光染色2～3 min；用掃描儀分別掃描5片心肌的正、反面，獲得掃描圖像，用多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每片心肌雙側(cè)的梗死區(qū)(N-BT非染色區(qū)，呈灰白色)和非梗死區(qū)(N-BT染色區(qū)，呈藍(lán)黑色)面積，計(jì)算梗塞區(qū)面積占心室面積百分比(AI/V)和梗塞區(qū)面積占全心面積百分比(AI/WH)。

2　結(jié)果

2.1雙龍方對(duì)心肌無(wú)復(fù)流面積和心梗面積的影響Fig 1、2及Tab 1結(jié)果顯示，與模型組比較，雙龍方高、中劑量組的心肌無(wú)復(fù)流面積和梗死面積均明顯減小(P<0.01或P<0.05)，雙龍方低劑量組的心肌無(wú)復(fù)流面積和梗死面積有減小趨勢(shì)。

2.2雙龍方對(duì)心功能的影響Fig 3、Tab 2心臟B超結(jié)果顯示，與模型組比較，雙龍方高、中劑量組前壁厚度明顯增加，收縮末期左心室內(nèi)徑和容積明顯降低，短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)和每搏輸出量明顯提高(P<0.01或P<0.05)；雙龍方低劑量組前壁厚度、射血分?jǐn)?shù)明顯增加(P<0.01或P<0.05)，后壁厚度、短軸縮短率、每搏輸出量有增加趨勢(shì)，左心室內(nèi)徑和容積有降低趨勢(shì)。

Fig 1　Effects of Shuanglong formula on myocardial infarct area in I/R rats

A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1group; D: SLF 2.5 g·kg-1group; E: SLF 1.25 g·kg-1group

Fig 2　Effects of Shuanglong formula on no-reflow area in I/R rats

A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1group; D: SLF 2.5 g·kg-1group; E: SLF 1.25 g·kg-1group

Fig 3　Effect of Shuanglong formula on cardiac function evaluated by echocardiography

A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1group; D: SLF 2.5 g·kg-1group; E: SLF 1.25 g·kg-1group

Tab 1　Effects of Shuanglong formula on myocardial infarct area and no-reflow area in I/R rats(±s)

*P<0.05，**P<0.01vsI/R

2.3雙龍方對(duì)心肌血液灌注的影響Fig 4、Tab 3心肌聲學(xué)造影結(jié)果顯示，與模型組比較，雙龍方高、中、低劑量組左心室前壁心肌組織的微血管密度、局部心肌灌注量、峰值視頻強(qiáng)度PI值明顯增加(P<0.01或P<0.05)；雙龍方高劑量組局部血流速度明顯增加(P<0.01)；雙龍方中、低劑量組局部血流速度有增加趨勢(shì)。

2.4雙龍方對(duì)心肌血液灌注的影響Tab 4結(jié)果顯示，與模型組比較，各組心肌損傷相關(guān)的血液學(xué)指標(biāo)未見(jiàn)明顯改善，血清cTnT、CRP、CK、LDH水平未見(jiàn)明顯變化。

3　討論

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有學(xué)者就中醫(yī)藥防治無(wú)復(fù)流進(jìn)行了一些研究，但是研究?jī)?nèi)容和深度非常有限。本課題組采用李連達(dá)院士經(jīng)驗(yàn)方雙龍方對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注后無(wú)復(fù)流的影響及其機(jī)制進(jìn)行研究。研究顯示，雙龍方可以明顯減小心肌無(wú)復(fù)流面積和梗死面積；明顯改善心功能指標(biāo)，明顯增加左心室前壁缺血區(qū)厚度，明顯降低收縮末期左心室內(nèi)徑和容積，明顯提高短軸縮短率、射血分?jǐn)?shù)和每搏輸出量；明顯增加左心室前壁心肌組織的微血管密度、血流速和血液灌注量；心肌酶學(xué)指標(biāo)，模型組有升高趨勢(shì)，雙龍方干預(yù)組有降低趨勢(shì)，但是差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與實(shí)驗(yàn)樣本量較小、檢測(cè)過(guò)程存在誤差有關(guān)。

Fig 4　Effect of Shuanglong formula on regional myocardial blood flow

A: Sham group; B: I/R group; C: SLF 5 g·kg-1group; D: SLF 2.5 g·kg-1group; E: SLF 1.25 g·kg-1group

Tab 2　Effect of Shuanglong formula on cardiac function evaluated by echocardiography(±s)

*P<0.05，**P<0.01vsI/R

Tab 3　Effect of Shuanglong formula on regional myocardial blood flow(±s)

**P<0.01，*P<0.05vsI/R

Tab 4　Effect of Shuanglong formula on levels of LDH, CK, cTnT, and CRP(±s)

現(xiàn)代藥理研究表明，雙龍方中的兩味藥——丹參和人參均具有較強(qiáng)的心血管活性。丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物的干燥根及根莖，性苦微寒， 有活血化瘀、 養(yǎng)心除煩之功效。其心血管活性作用包括：①阻滯鈣通道[8]，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈流量；②改善心肌能量代謝，降低心肌能量消耗而不損傷心??；③改善外周血液循環(huán)、加快微循環(huán)血液流通、增加毛細(xì)血管網(wǎng)；④降低血液黏度，抑制血小板的激活、聚集性和黏附性，抑制血栓形成[9-10]；⑤清除氧自由基[11]，提高機(jī)體耐缺氧能力、保護(hù)心肌細(xì)胞。人參是五加科人參屬植物人參(PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥根，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智之效。其心血管系統(tǒng)的作用主要表現(xiàn)為：①保護(hù)心功能，抑制急性心肌梗死導(dǎo)致的心室重構(gòu)、改善心功能[12]；②改善微循環(huán)[13]，擴(kuò)張微血管管徑、增加微血管血流速度和微血管交叉網(wǎng)點(diǎn)數(shù)目；③抗自由基，對(duì)抗心肌細(xì)胞缺氧性損傷[14]；④改善血液黏稠度、促進(jìn)急性心肌梗死后的心肌血管再生[15]。此外，人參還能提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的抵抗力和耐受性。由上可知，無(wú)論從雙龍方“益氣活血”的配伍理論分析，還是從其所含兩味藥的現(xiàn)代藥理活性，雙龍方對(duì)無(wú)復(fù)流都具有一定防治作用，與本項(xiàng)目研究結(jié)果一致。

本項(xiàng)目研究顯示雙龍方可以有效防治心肌缺血/再灌注后的無(wú)復(fù)流現(xiàn)象，為臨床上中醫(yī)藥防治無(wú)復(fù)流提供了可行性思路和科學(xué)依據(jù)。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)是在首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)科研樓機(jī)能實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，非常感謝許晴老師的指導(dǎo)和幫助！)

參考文獻(xiàn)：

[1]Reffelmann T, Hale S L, Dow J S, et al. No-reflow phenomenon persists long-term after ischemia/reperfusion in the rat and predicts infarct expansion [J].Circulation, 2003,108(23):2911-7.

[2]Gick M, Jander N, Bestehorn H P, et al. Randomized evaluation of the effects of filter-based protection on myocardial perfusion and infarct size after primary percutaneous catheter intervention in myocardial infarction with and without ST segment elevation[J].Circulation, 2005,112(10): 1462-9.

[3]韓蕾, 鮑百麗. 阿魏酸鈉對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注后無(wú)復(fù)流的影響[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2013,42(14) : 1607-10.

[3]Han L，Bao B L. Effects of sodium ferulate on no-reflow in rats of acute myocardial infarction and reperfusion[J].ChongqingMed, 2013,42(14) : 1607-10.

[4]甘立軍, 張春卉, 張猛, 等. 冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射血塞通對(duì)ST段抬高型急性心肌梗死介入術(shù)中緩再流現(xiàn)象的影響[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2010,30(4):348-51.

[4]Gan L J，Zhang C H，Zhang M, et al. Effect of intracoronary injection with Xuesaitong in treating post-PCI slow-reflow phenomenon in patients with ST-segment elevation myocardial infarction[J].ChinJIntegrTraditWestMed, 2010,30(4): 348-51.

[5]呂琳星, 范雪梅, 梁瓊麟, 等. 基因芯片用于組分中藥新雙龍方的配伍機(jī)制研究[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2012,33(11):2397-404.

[5]Lyu L X，F(xiàn)an X M，Liang Q L, et al. cDNA microarray for the study of compatibility mechanism of multi-component Chinese medicine new Shuanglong formula[J].ChemicalJChinUniv, 2012,33(11):2397-404.

[6]梁曉萍, 陳曦, 王義明. 雙龍方配伍配比對(duì)大鼠急性心肌缺血模型的影響[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011,36(22): 3176-9.

[6]Liang X P，Chen X，Wang Y M. Effect of compatibilities and proportions of Shuanglong formula on acute myocardial infarction in rats[J].ChinaJChinMaterMed, 2011,36(22): 3176-9.

[7]李連達(dá)，張榮利，劉成源，等. 雙龍方與自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)心導(dǎo)管移植對(duì)中國(guó)小型豬心肌梗死的影響[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2003,12(12):999-1004.

[7]Li L D，Zhang R L，Liu C Y, et al. The effects of Shuanglongfang therapy plus bone marrow mononuclear cells autotransplantation on myocardial infarction in swines[J].ChinNewDrugsJ, 2003,12(12):999-1004.

[8]蔡茂生，韋永強(qiáng). 丹參凍干粉針聯(lián)合低分子肝素鈣治療不穩(wěn)定性心絞痛的臨床研究[J]. 內(nèi)科, 2008,3(6):831-3.

[8]Cai M S，Wei Y Q. Danshen freeze-dried powder injection combined with low molecular heparin calcium sodium in treatment of unstable angina pectoris[J].InternalMedChina, 2008,3(6):831-3.

[9]陳俞材，方蓮花，杜冠華. 丹參水溶性化合物抗心肌缺血作用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(2):162-5.

[9]Chen Y C，F(xiàn)ang L H，Du G H. Research advances in protective effects of water soluble compounds in Salvia miltiorrhiza against myocardial ischemia [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(2):162-5.

[10] 劉慧穎，姜長(zhǎng)濤，馮娟，等. 丹參酮類化合物研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(12):1643-7.

[10] Liu H Y，Jiang C T，F(xiàn)eng J, et al. Research progress of Tanshinones [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(12):1643-7.

[11] Fu J， Huang H， Liu J， et al． TanshinoneⅡA protects cardiac myocytes against oxidative stress -triggered damage and apoptosis[J].EurJPharmacol，2007，568(1-3):213-21.

[12] 魏英，余麗梅，王鈺瑩，等. 人參總皂苷促進(jìn)血管新生改善急性心肌梗死大鼠心功能[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2016,32(4):559-64.

[12] Wei Y，Yu L M，Wang Y Y, et al. Total ginsenosides improve cardiac function via promoting angiogenesis in a rat model of acute myocardial infarction[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(4):559-64.

[13] 邱雪，洪鐵，孟勤，等. 人參皂苷單體Rb1、Re及Rg1對(duì)腎上腺素所致小鼠耳廓微循環(huán)障礙的改善作用[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2009,35(2):314-7.

[13] Qiu X，Hong T，Meng Q, et al. Improvement of Ginsenoside Rb1,Re and Rg1 on mouse auricle microcirculation disorder induced by adrenaline[J].JJilinUniv(MedEd) , 2009,35(2):314-7.

[14] 許浩，葛亞坤，鄧同樂(lè)，等. 人參皂苷Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2005，21(7): 803-6.

[14] Xu H，Ge Y K，Deng T L, et al. Protective effect of ginsenoside Rb1 against H2O2-induced apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes[J].ChinPharmacolBull，2005，21(7): 803-6.

[15] Leung K W, Pon Y L, Wong R N, et al. Ginsenoside-Rg1 induces vascular endothelial growth factor expression through the glucocorticoid receptor-related phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and beta-catenin/T-cell factor-dependent pathway in human endothelial cells [J].JBiolChem, 2006,281(47): 36280-8.