佐劑性關節(jié)炎大鼠滑膜及血清中MANF的表達及其與炎癥的相關性

馬鈺泱，狄澤敏，曹　晴，沈玉君，沈玉先，馮利杰

( 安徽醫(yī)科大學 1. 基礎醫(yī)學院，2. 生物藥物研究所, 安徽 合肥　230032 )

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以關節(jié)病變?yōu)橹鞯穆匀硇宰陨砻庖咝约膊?。其病理特點為關節(jié)滑膜病變，包括滑膜細胞過度增生，淋巴細胞、漿細胞浸潤，血管翳形成，關節(jié)骨和軟骨破壞等，最終導致關節(jié)軟骨基質和關節(jié)囊的破壞，關節(jié)強直畸形，失去原有的功能，嚴重影響了病人的生活質量[1-2]。RA發(fā)病機制復雜，迄今未有定論。深入探討RA的發(fā)病機制，可為其臨床診斷和治療提供新思路和新靶標。內質網(endoplasmic reticulum, ER)應激是指在缺氧、氧化應激、鈣平衡失調等情況下，ER內未折疊或錯誤折疊的蛋白明顯增多，一旦超出ER的負荷能力，細胞會激活相關信號級聯(lián)反應來恢復ER內正常的蛋白折疊環(huán)境[3-4]。已有研究報道，ER應激參與了RA的病理過程[5]。中腦星形膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(mesencephalic astrocyte- derived neurotrophic factor, MANF)基因是我們通過微陣列(microarray)技術，從30000個基因中篩選出的對ER應激最敏感的基因[6]，其編碼的MANF蛋白是一個分泌蛋白，ER應激可上調其表達和分泌[7]。為了了解MANF在RA中的表達情況，我們以佐劑性關節(jié)炎(adjuvant arthritis, AA)大鼠為疾病模型，檢測致炎后不同時期大鼠關節(jié)滑膜中MANF和ER應激標志蛋白BiP和CHOP的表達，以及血清中MANF和急性期反應蛋白(C-reactive protein, CRP)、白細胞介素1β(interleukin-1 β, IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的水平；分析MANF表達與關節(jié)炎癥狀、CRP、IL-1β和TNF-α的相關性，探討MANF在關節(jié)炎癥中可能發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物SPF級SD大鼠，♂，體質量(200±20)g，共50只，由安徽省實驗動物中心提供。

1.1.2試劑弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant, FCA)購自Sigma公司；蘇木精和伊紅購自國藥集團化學試劑有限公司；IL-1β、TNF-α的ELISA試劑盒購自武漢博士德公司；CRP的ELISA試劑盒購自R&D公司；MANF的ELISA試劑盒由本實驗室制備[8]；ECL顯色試劑盒購自Pierce公司；MANF單克隆抗體由本實驗室制備[9]；兔抗BiP多克隆抗體購自Abcam公司；兔抗CHOP多克隆抗體購自Santa Cruz公司；HRP標記的GAPDH抗體購自上?？党缮锕こ逃邢薰?。

1.1.3儀器YLS2TA足爪容積測量儀(山東省醫(yī)學科學院設備站)；Electron Px2型PCR儀(美國Thermo公司)；JY92-ⅡD型超聲波粉碎機(寧波海曙科生超聲設備有限公司)；凝膠成像系統(tǒng)(珠海Hema公司)。

1.2　方法

1.2.1大鼠AA模型的建立50只SD大鼠，隨機分為正常組和模型組，其中正常組10只，模型組40只。常規(guī)消毒大鼠左后側足趾，模型組大鼠左后足跖皮內注射1 g·L-1的FCA 0.1 mL致炎，正常對照組大鼠于相同部位注射等量生理鹽水，此后每天觀察大鼠的活動及關節(jié)腫脹情況。

1.2.2關節(jié)腫脹度測定致炎前(d 0)和致炎后d 7、14、21、28，用足爪容積測量儀測定大鼠右后側(非致炎側)足容積，求出關節(jié)腫脹度(△mL=致炎后容積-致炎前容積)，以評價AA大鼠關節(jié)繼發(fā)炎癥變化。

1.2.3多發(fā)性關節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI)評分采用AI評分評價關節(jié)炎病變的發(fā)展及嚴重程度。AI分為5分，0分：無紅腫；1分：趾關節(jié)紅腫；2分：趾關節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節(jié)在內的全部足爪腫脹。根據未注射佐劑的3個肢體的病變程度累計積分，計算出AI。

1.2.4HE染色大鼠造模3周后處死，取膝關節(jié)，用質量濃度40 g·L-1的多聚甲醛室溫固定3 d，質量濃度100 g·L-1的EDTA室溫脫鈣4周，之后常規(guī)制備石蠟切片，切片厚度為5 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染色5 min，體積分數(shù)0.1的鹽酸乙醇分色3 s，伊紅染色5 min，常規(guī)脫水后二甲苯透明20 min，中性樹膠封片。

1.2.5Western blot取正常以及致炎后d 2、7、14、21、28大鼠繼發(fā)側膝關節(jié)滑膜組織充分裂解，100℃變性10 min，SDS-PAGE電泳后濕轉至PVDF膜， 用含0.5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉30 min后，加入適當稀釋度的一抗4℃孵育過夜，PBST洗10 min×3次后，加入適當稀釋度的二抗室溫孵育1 h，PBST洗10 min×3次后，ECL顯影。

1.2.6逆轉錄PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)取正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠繼發(fā)側膝關節(jié)滑膜組織，提取RNA后，逆轉錄為cDNA。 PCR擴增反應總體積20 μL，cDNA模板1 μL，引物(10 mol·L-1)1 μL，2×Premix Extaq 10 μL，去RNase無菌水8 μL，反應條件為95℃預變性5 min，94℃變性60 s，55℃(BiP、MANF、β-actin)或58℃(CHOP)退火60 s，72℃延伸60 s，擴增35個循環(huán)，72℃延伸10 min。BiP引物：上游5′-GGTATTG AAACTGTGGGAGG-3′，下游5′-TTGTCTTCAGCTGTCACTCG-3′；CHOP引物：上游5′-GGAGCTGGAAGCCTGGTATGA-3′，下游5′-TCCCTGGTCAGGCGC TCGATTT-3′；MANF引物：上游5′-TCCGCTACT GTAAGCAAGGT- 3′，下游5′-CT TCACCTAGGATCTTGGTG-3′；β-actin引物：上游5′-TCACCAACTGGGACGACAT-3′，下游5′-GCACAGCCTGGATAGCAAC-3′。

1.2.7ELISA檢測取正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠血清，分別采用MANF、CRP、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒，按說明書操作。用Curve Expert軟件進行計算。

2　結果

2.1AA大鼠模型評價致炎后d 1注射足爪明顯紅腫，持續(xù)3 d后，逐漸減輕；致炎后d 12左右，非致炎右后足出現(xiàn)腫脹，開始主要表現(xiàn)在踝關節(jié)，逐漸累及整個腳趾，腳趾關節(jié)間及前足跖出現(xiàn)關節(jié)腫大，局部皮膚充血、紅腫，d 21左右達到高峰，隨后逐漸減輕。在致炎后d 7、14、21、28分別測量大鼠右后側足容積。與正常對照組相比，致炎后d 14開始，AA大鼠的繼發(fā)側關節(jié)腫脹度明顯增加，d 21左右達到高峰，隨后稍有下降，一直持續(xù)到d 28(Tab 1)；AI評分顯示，致炎后d 14左右，AA大鼠開始出現(xiàn)全身癥狀，表現(xiàn)為未注射CFA的其余3個肢體關節(jié)紅腫、變形，耳部及尾部結節(jié)，行走不便，消瘦等，AI評分明顯升高，致炎后d 21 AI評分達到高峰并維持至d 28(Fig 1)。以上實驗結果證明AA大鼠模型成功。

Fig 1　Change of arthritis index of AA rats (±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsd 7

Tab 1　The paw swelling in secondaryinflammation of AA rats (±s, n=6)

**P<0.01vsnormal group

2.2AA大鼠膝關節(jié)病理改變HE染色結果顯示，正常對照大鼠膝關節(jié)關節(jié)囊的滑膜細胞僅有2～3層，排列規(guī)則，滑膜組織無血管增生和炎細胞浸潤(Fig 2A)；AA大鼠膝關節(jié)滑膜襯里層增厚，滑膜組織呈絨毛狀或指狀肥大，伸入到關節(jié)腔內，滑膜組織內可見大量炎細胞浸潤，血管壁及其周圍區(qū)域炎細胞浸潤尤為明顯。新生血管形成，關節(jié)軟骨表面可見剝脫、缺損(Fig 2B)。

Fig 2　Histopathology of knee joint in normal and AA rats (scale bar=100 μm)

A: In normal control rats, synoviocytes were monolayer (A1) and articular cartilages were normal (A2); B: 21 days after FCA injection, synoviocytes proliferated three to six layers, inflammatory cells infiltrated into synovium, and pannus was formed (B1, B2), destruction of articular cartilages (B1, B3) and extensive newborn vessels (B4) were present in the hyperplastic synovium of the AA knee (arrows).

2.3AA大鼠炎癥不同時期滑膜組織MANF、BiP和CHOP的表達取正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠繼發(fā)側膝關節(jié)滑膜組織，分別提取RNA和蛋白，采用RT-PCR和Western blot檢測MANF、BiP、CHOP的mRNA和蛋白水平。結果顯示，MANF蛋白水平在致炎后d 2～7緩慢升高，d 14左右達到峰值，隨后緩慢下降，d 28仍高于正常水平；ER應激蛋白BiP在致炎后d 2明顯上調，隨后略有下降，但仍維持較高水平；而CHOP則一直維持在低水平緩慢上升的狀態(tài)(Fig 3B)；RT-PCR結果也顯示，相似的表達趨勢(Fig 3A)，提示關節(jié)炎癥能誘導ER應激和MANF表達。

2.4AA大鼠血清中MANF水平及其與關節(jié)炎嚴重程度的相關性分析收集正常和致炎后d 2、7、14、21、28大鼠血清，ELISA檢測MANF水平。結果顯示，與正常組相比，致炎后d 2血清中MANF水平開始明顯升高，d 14達到峰值，d 21開始下降，d 28仍高于正常水平(Tab 2)。為了進一步研究血清中MANF水平與關節(jié)炎嚴重程度的相關性，我們將致炎后不同時期血清中MANF水平與關節(jié)腫脹度和AI評分進行了相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)，在繼發(fā)性反應期，AA大鼠血清中MANF水平與二者均存在負相關，與關節(jié)腫脹度的相關系數(shù)為0.939 4，與AI評分的相關系數(shù)為0.954 1(Fig 4)。

Tab 2　Levels of MANF, CRP, IL-1β and TNF-α in bloodserum of AA rats at different phases (±s, n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsd 0

2.5AA大鼠血清中MANF水平與CRP的相關性分析ELISA檢測正常和致炎d 2、7、14、21、28大鼠血清CRP的水平(Tab 2)，結果顯示，與MANF相似的變化趨勢；相關性分析發(fā)現(xiàn)MANF和CRP有著明顯的相關性，相關系數(shù)r=0.943 3(Fig 4)。

2.6AA大鼠血清中MANF水平與IL-1β、TNF-α的相關性分析為了進一步研究血清中MANF水平與炎癥因子的關系，我們檢測了致炎不同時期血清中IL-1β和TNF-α的水平。ELISA結果顯示，IL-1β在致炎后d 21明顯增高，TNF-α在致炎d 2明顯增高，到d 21～28趨于平緩(Tab 2、Fig 4)。相關性分析結果顯示，在繼發(fā)性反應期，血清MANF水平與IL-1β和TNF-α呈負相關，相關系數(shù)分別為0.900 4和0.938 1(Fig 5)。

Fig 3　Expressions of MANF, BiP and CHOP in synovium during course of AA

A: The mRNA levels of MANF, BiP and CHOP in synovium; B: The quantitative data in A were normalized by β-actin; C: The protein levels of MANF, BiP and CHOP in synovium; D: The quantitative data in C were normalized by GAPDH. Error bars represent data from three independent experiments.*P<0.05,**P<0.01vsd 0.

3　討論

AA模型一般分為兩個時相，即原發(fā)性反應期和繼發(fā)性反應期。原發(fā)病變屬急性炎癥反應，表現(xiàn)為致炎側的關節(jié)、足跖紅腫，致敏后即可出現(xiàn)，18～24 h達峰值，持續(xù)3～5 d后逐漸減輕；而繼發(fā)性反應則是機體免疫功能紊亂所造成的免疫性炎癥表現(xiàn)，表現(xiàn)為造模后10 d左右再度出現(xiàn)的致炎側、非致炎側及雙前肢的關節(jié)和足趾腫脹，耳、尾關節(jié)炎結節(jié)，以及體重下降等全身變化；與人類RA近似。RA的發(fā)病機制十分復雜，至今尚未明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜細胞核內有ER定位的轉錄因子ATF6的激活[10]。ER應激標志蛋白BiP在RA滑膜組織中高表達，80% RA患者血清中存在抗BiP抗體[11]。外源性的重組人BiP能促進外周血單核細胞中抗炎因子IL-10的表達，抑制TNF-α表達，從而抑制炎癥。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，BiP在兔免疫性關節(jié)炎滑膜組織中表達上調[12]。本研究中我們進一步觀察了BiP在AA大鼠不同階段的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)BiP在AA大鼠急性炎癥期(d 2)表達明顯升高，此后一直維持較高的水平。根據以往文獻報道，我們推斷BiP可能具有抑制炎癥的作用，那么如何解釋在BiP表達上調以及ER應激激活的情況下，炎性滑膜細胞仍然處于高度增殖的狀態(tài)？我們推測，RA中是否還存在其他調控細胞增殖與凋亡平衡的因素存在，從而影響滑膜細胞的功能。因此，我們檢測了CHOP表達。CHOP屬于C/EBP轉錄因子家族的凋亡前因子，在ER應激誘導細胞凋亡中起著主導作用，也是公認的ER應激標志蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，AA進程中CHOP水平一直維持在緩慢上升的狀態(tài)。CHOP在AA中持續(xù)低水平狀態(tài)也進一步證明了滑膜細胞的異常增殖可能與ER應激狀態(tài)下增殖與凋亡失衡有關。

Fig 4　Correlation between serum MANF level with arthritis symptoms and CRP level in AA rats

A: Correlation analysis of serum MANF level with swell of hind paw in the secondary inflammatory period of AA rats; B: Correlation analysis between serum MANF level with arthritis index in the secondary inflammatory period; C: Correlation analysis between MANF with CRP levels in serum in the secondary inflammatory period of AA rats.

Fig 5　Relationship between MANF levels and IL-1β(A) or TNF-α(B) in serum of AA rats

MANF基因是我們從30 000個基因中篩選出的對ER應激最敏感的基因，在ER應激時其mRNA水平被上調8倍以上[6]，我們推測MANF作為ER應激敏感基因，可能參與了關節(jié)炎癥誘導ER應激的過程。本研究發(fā)現(xiàn)，正?；そM織中MANF僅有少量表達，可能用于維持正?；すδ埽卵缀骴 2 MANF表達略有升高，到d 14左右MANF表達明顯升高，隨后逐漸下降，因此，我們認為MANF參與了AA炎癥反應的全過程，且其對繼發(fā)性炎癥刺激的敏感程度高于BiP和CHOP。

MANF是一個分泌蛋白，ER應激能上調其表達和分泌。那么關節(jié)炎癥能否誘導MANF分泌增加？我們發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠相比，AA大鼠血清中MANF水平明顯升高，在繼發(fā)性反應初期達到峰值，隨后有下降趨勢，直到炎癥消退時，其水平仍高于正常水平，提示AA炎癥能誘導MANF分泌，并且MANF對繼發(fā)性炎癥刺激較為敏感。CRP是RA臨床實驗室檢查的重要項目，CRP與RA的活動程度、骨質破壞程度及受累關節(jié)數(shù)相關，在RA活動期，CRP明顯升高，與血沉(erythrocyte sedimentation rate, ESR)升高相平行，但比ESR升高出現(xiàn)的早，消失的也快，是反映炎癥活動程度和治療效果的良好指標[13]。我們的結果顯示，AA大鼠血清CRP水平與MANF的升高水平呈正相關，因此，血清中MANF水平也可考慮作為RA臨床早期診斷和評價疾病活動性的新指標。

本研究還進一步分析了AA大鼠外周血中MANF水平與繼發(fā)性反應期足爪腫脹度、AI評分及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β之間的相關性。結果發(fā)現(xiàn)在繼發(fā)性反應期，外周血MANF水平與AA癥狀、TNF-α和IL-1β之間存在負相關。目前已有報道MANF能通過抑制NF-κB活性、調控p38 MAPK通路，抑制炎癥[14-15]，因此，AA中MANF的表達和分泌可能與繼發(fā)性炎癥進展密切相關。

綜上所述，AA炎癥伴隨著ER應激，而MANF作為ER應激敏感蛋白，在AA中表達上調，尤其是在繼發(fā)性反應初期；同時AA能誘導MANF分泌增加，血清MANF水平可考慮作為臨床早期診斷和評價疾病活動性的新指標。通過MANF水平與關節(jié)繼發(fā)性炎癥及血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β之間的相關性分析，我們推測MANF的表達與RA的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系，但其作用機制有待進一步研究。

(致謝：本文實驗內容在安徽醫(yī)科大學科教大樓生物藥物研究所完成，感謝實驗室老師與同學的幫助。)

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