丹紅注射液對高脂血癥大鼠肝臟AMPK/SREBP-1/ACC通路的影響

陳　娟, 汪胡風, 鄧　軍, 周惠芬, 萬海同, 楊潔紅

(1. 浙江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院, 浙江 杭州　310053; 2. 浙江省醫(yī)學科學院安全性評價研究中心, 浙江 杭州　310013)

高脂血癥是由于各種原因?qū)е卵獫{中總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三脂(triglyceride, TG)和(或)低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein- cholesterol, LDL-C)過高或高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein- cholesterol, HDL-C)過低的一種脂代謝異常性疾病，又被稱為脂質(zhì)異常血癥[1]。世界衛(wèi)生組織調(diào)查統(tǒng)計顯示，高脂血癥是心血管疾病發(fā)生的主要危險因素之一，而心血管疾病則是目前全球疾病的頭號死因。

丹紅注射液(Danhong injection, DHI)是由活血藥對丹參、紅花通過現(xiàn)代工藝精制而成的具有活血化瘀、通脈舒絡功效的中藥復方制劑[2]。其主要活性成分是丹參素、丹酚酸和原兒茶醛等，有抑制血小板聚集、抗炎癥損傷、保護血管內(nèi)皮、抗細胞凋亡等藥理作用，臨床上主要用于冠心病、心絞痛、腦梗死、血管性癡呆、糖尿病和高脂血癥等的治療[3]。腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]是一種廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸激酶，膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(sterol regulatory element-binding transcription factor 1, SREBP-1)是脊椎動物細胞脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)物，而乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)可以催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪合成的限速酶[4]，后兩者均為前者的下游效應因子。大量研究表明，激活AMPK，抑制SREBP-1和ACC可以改善和治療高脂血癥[5-7]。

雖然DHI在降脂方面發(fā)揮著重要的作用，許多研究也證明了DHI對高脂血癥具有非常明顯的臨床療效[3]，但目前國內(nèi)外有關(guān)DHI如何調(diào)節(jié)高脂血癥的機制研究，無論是在動物實驗還是細胞實驗方面都非常少。課題組通過前期研究發(fā)現(xiàn)[3]，DHI可以影響高脂血癥大鼠ACC、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶I(carnitine palmitoyltransferase I, CPT-I)、過氧化物酶增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha, PPAR-α)的mRNA表達水平，預實驗發(fā)現(xiàn)SREBP-1的蛋白表達水平在藥物干預組明顯降低，推測DHI的調(diào)脂機制是通過干預AMPK-SREBP-1通路來影響下游脂質(zhì)代謝相關(guān)酶來實現(xiàn)的。因此，該實驗以高脂血癥大鼠為模型，通過腹腔注射不同劑量的DHI來探究DHI通過AMPK/SREBP-1/ACC通路預防和治療高脂血癥的作用機制。

1　材料

1.1實驗動物清潔級♂ SD大鼠48只，體質(zhì)量(200±10)g，由浙江中醫(yī)大學動物實驗研究中心提供。實驗所用的基礎(chǔ)飼料由動物實驗中心提供，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK(滬)2008-0115，適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。所有大鼠均根據(jù)實驗動物飼養(yǎng)與使用指南喂養(yǎng)(NIH Publications, No.80-23, 1996年修訂版)，飼養(yǎng)條件：溫度(23±1)℃，相對濕度(55±5)%，光暗各12 h，自由進食飲水[3-4]。

1.2藥物與試劑高脂飼料(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，配方為基礎(chǔ)飼料68%、豬油10%、蛋黃粉10%、蔗糖10%、膽固醇2%)；丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司，批號111050，規(guī)格10 mL)；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；內(nèi)參β-actin、ACC、p-ACC抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；AMPK、p-AMPK、SREBP-1抗體購自英國Abcam公司；二抗購自美國LI-COR公司。

1.3儀器高速低溫離心機(美國Thermo公司)；Precellys 24多功能樣品均質(zhì)器(法國Bertin公司)；垂直電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；Odyssey CLx紅外成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

2　方法

2.1實驗動物分組與給藥選用清潔級♂ SD大鼠48只，參照鄧祖躍等[8]的方法，制備高脂血癥大鼠模型，實驗開始前先用普通飼料進行1周的適應性喂養(yǎng)，之后隨機選取12只為基礎(chǔ)對照組，飼以普通飼料，其余飼以高脂飼料，每天12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由飲水進食。于第6周末夜間禁食12 h后，眼眶采血檢測血脂水平，血脂含量升高并與基礎(chǔ)對照組差異明顯的大鼠作為成功的高脂模型納入實驗。選取成功的高脂模型大鼠，按血脂水平隨機分為高脂對照組和腹腔注射DHI低、高劑量組(1.0、2.0 mL·kg-1·d-1)，每組12只大鼠。兩個對照組腹腔注射等體積生理鹽水，每天注射1次，連續(xù)30 d。腹腔注射實驗期間，除基礎(chǔ)對照組外，其余各組大鼠均飼以高脂飼料，自由進食飲水[9]。

2.2樣品采集丹紅注射液腹腔注射30 d后，大鼠禁食12 h，腹主動脈取血，收集血液3 000×g離心15 min，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?；取適量肝臟組織，液氮保存，立即存入。

2.3AMPK、p-AMPK、SREBP-1、ACC、p-ACC蛋白表達的測定各組取適量肝臟樣本，加入含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑，勻漿后抽提總蛋白。BCA法進行蛋白質(zhì)定量。抽提好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳完成后將凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，30 mA恒流條件下，4℃過夜。轉(zhuǎn)膜完成后的PVDF膜在含5 %脫脂奶粉的封閉液中，室溫孵育1 h封閉，封閉后加抗體(一抗、二抗)孵育，孵育完成后在Odyssey CLx紅外成像系統(tǒng)上掃膜，確定樣品中AMPK、p-AMPK、SREBP-1、ACC、p-ACC表達的相對含量。

3　結(jié)果

3.1DHI對高脂血癥大鼠肝臟AMPK和p-AMPK蛋白表達的影響如Fig 1所示，與對照組相比，高脂對照組中AMPK的蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)；與高脂對照組相比，DHI低、高劑量組能明顯降低肝臟AMPK的蛋白表達水平(P<0.01，P<0.05)。與對照組相比，DHI高劑量組能明顯增高肝臟p-AMPK的蛋白表達水平(P<0.05)，與高脂對照組相比，DHI高劑量組p-AMPK的蛋白表達水平增高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Fig 1　Relative expressions of AMPK and p-AMPK in rat liver of each group

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

3.2DHI對高脂血癥大鼠肝臟SREBP-1蛋白表達的影響如Fig 2所示，與對照組相比，高脂對照組中SREBP-1的蛋白表達無明顯差異(P>0.05)，DHI低、高劑量組SREBP-1表達明顯下降(P<0.05)；與高脂對照組相比，DHI高劑量組能明顯降低肝臟SREBP-1蛋白的表達水平(P<0.05)。

3.3DHI對高脂血癥大鼠肝臟ACC、p-ACC蛋白表達的影響如Fig 3所示，與對照組相比，DHI高劑量組ACC蛋白表達明顯下降(P<0.05)，高脂對照組中p-ACC的蛋白表達明顯下降(P<0.01)；與高脂對照組相比，DHI低劑量組能明顯升高肝臟p-ACC蛋白的表達水平(P<0.05)。

Fig 2　Relative expressions of SREBP-1 in rat liver of each group

*P<0.05vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group.

Fig 3　Relative expressions of ACC and p-ACC in rat liver of each group

*P<0.05,**P<0.01vsnormal control group;#P<0.05vsmodel group

4　討論

本研究應用SD大鼠高脂血癥模型評價了DHI的降脂活性，并探討了其基于AMPK/SREBP-1/ACC通路的降脂作用機制。經(jīng)過高脂飼料誘導后，SD大鼠的血清TC、TG、LDL-C的水平均明顯升高，提示造模成功[3]。

AMPK是調(diào)節(jié)能量代謝的重要蛋白，其在脂肪酸代謝方面起到重要調(diào)節(jié)作用[10]。通過感受胞質(zhì)內(nèi)AMP 與ATP比值的變化，AMPK可以調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化代謝，當AMP/ATP增高時，AMPK磷酸化為p-AMPK而激活[11]。在本實驗中，與高脂對照組相比，DHI低、高劑量組能明顯降低肝臟AMPK的蛋白表達水平(P<0.05)；與對照組相比，DHI高劑量組能明顯增高肝臟p-AMPK的蛋白表達水平(P<0.05)，這可能是由于DHI促進AMPK磷酸化為p-AMPK，降低了AMPK的蛋白表達水平。研究表明，蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)的降解[12]。而且在DHI的作用下，AMPK的下游因子SREBP-1和ACC活性的抑制也可以間接證明DHI通過AMPK蛋白調(diào)控了脂肪酸的代謝。

激活的AMPK可以使ACC磷酸化而失活[13]。ACC通過催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，在脂肪酸的代謝過程中發(fā)揮重要的作用，而抑制ACC活性可以抑制脂質(zhì)的合成[14]。在本實驗中，DHI明顯升高了肝臟p-ACC蛋白的表達水平，表明DHI通過促進ACC磷酸化抑制ACC的活性，從而抑制脂質(zhì)的合成。激活的AMPK同時通過磷酸化SREBP-1抑制其進入細胞核。SREBP-1是肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，廣泛參與機體脂質(zhì)代謝，如甘油三酯、膽固醇和脂肪酸的合成或攝取等。在本實驗中，與高脂對照組相比，DHI明顯降低了高脂血癥大鼠肝臟SREBP-1的表達水平，抑制了脂質(zhì)的合成和攝取，從而減少脂肪的沉積。

另外，前期研究發(fā)現(xiàn)，當ACC的活性被抑制后，CPT-1的mRNA表達水平升高[3]。CPT-1在介導?；M入線粒體的過程中發(fā)揮了重要的作用，是線粒體β氧化的關(guān)鍵酶，其表達水平的升高促進了脂肪酸分解，降低了機體的脂肪含量[15]。

綜上所述，DHI能明顯降低SD大鼠血脂水平。本實驗通過Western blot檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，DHI可以激活AMPK/SREBP-1/ACC通路，即增強AMPK的活化，促進SREBP-1和ACC的磷酸化，抑制SREBP-1和ACC作用，減少脂質(zhì)的合成和攝取，增加脂質(zhì)分解，明顯降低血脂水平，從而改善高脂血癥。通過本研究與課題組前期研究結(jié)果[3]串聯(lián)分析，推測激活AMPK/SREBP-1/ACC通路可能是DHI防治高脂血癥的重要作用機制之一，根據(jù)相關(guān)結(jié)果繪制DHI干預AMPK/SREBP-1/ACC通路治療高脂血癥的作用機制圖(Fig 4)，闡釋DHI降脂機制。

Fig 4　Lipid-lowering mechanism of DHI through AMPK/SREBP-1/ACC pathway

(致謝：本文實驗在浙江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院、腦心同治研究院、動物實驗研究中心及浙江省醫(yī)學科學院安全性評價研究中心完成，在研究完成過程中得到了蔡月琴老師的悉心指導和熱忱幫助，在此深表謝意！)

參考文獻：

[1]陳華,陳淋,張男,等. 脂質(zhì)組學在高脂血癥的研究進展[J]. 藥物分析雜志,2016,36(8):1324-9.

[1]Chen H, Chen L, Zhang N, et al. Research progress of lipidomics in hyperlipidemia[J].ChinJPharmaceutAnalys, 2016,36(8):1324-9.

[2]張倩, 戴國梁, 居文政, 等. 丹紅注射液7種藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的人血漿蛋白結(jié)合率[J]. 中國藥理學通報, 2017,33(5):712-8.

[2]Zang Q, Dai G L, Ju W Z, et al. Determination of binding rates of human plasma protein with seven bioactive components in Danhong injection[J].ChinPharmacolBull, 2017,33(5):712-8.

[3]Chen J, Deng J, Zhang Y Y, et al. Lipid-lowering effects of Danhong injection on hyperlipidemia rats[J].JEthnopharmacol, 2014,154(2):437-42.

[4]Ahn C W, Jun D S, Na J D, et al. Alleviation of hepatic fat accumulation by betaine involves reduction of homocysteine via up-regulation of betaine-homocysteine methyltransferase (BHMT) [J].BiochemBiophysResCommun, 2016,477(3):440-7.

[5]Zheng Z G, Zhou Y P, Zhang X, et al. Anhydroicaritin improvesdiet-induced obesity and hyperlipidemia andalleviates insulin resistance by suppressing SREBPs activation[J].BiochemPharmacol, 2016,122:42-61.

[6]Kim B L, Woo M J, Park C S, et al. Hovenia Dulcis extract reduces lipid accumulation in oleic acid-induced steatosis of HepG2 cells via activation of AMPK and PPARα/CPT-1 pathway and in acute hyperlipidemia mouse model[J].PhytotherRes, 2017,31(1):132-9.

[7]Ren T Y, Zhu Y P, Kan J Q, et al. Zanthoxylumalkylamides activate phosphorylated AMPK and ameliorate glycolipidmetabolism in the streptozotocin-induced diabetic rats[J].ClinExpHypertens, 2017,39(4):330-8.

[8]鄧祖躍, 匡榮, 朱社敏, 等. 白藜蘆醇對高脂血癥大鼠多種抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 中國藥理學通報, 2013,29(1):147-8.

[8]Deng Z Y, Kuang R, Zhu S M, et al. Effects of resveratrol on multiple anti-oxidant systems in hyperlipidemia rats [J].ChinPharmacolBull, 2013,29(1):147-8.

[9]陳娟, 鄧軍, 張宇燕, 等. 丹參素對高脂血癥大鼠脂代謝調(diào)節(jié)機制研究[J]. 中國中藥雜志, 2015,40(2):313-7.

[9]Chen J, Deng J, Zhang Y Y, et al. Study on regulatory effect of Danshensu on lipid metabolism of hyperlipidemia rats[J].ChnJChinMaterMed, 2015,40(2):313-7.

[10] 徐軍, 王國恩, 章時杰, 等. 1,3,7,9-四甲基尿酸激活SirT3/AMPK/ACC信號通路減少高脂飲食小鼠肝臟脂肪化[J]. 中國藥理學通報, 2014,30(6):791-6.

[10] Xu J, Wang G E, Zhang S J, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiate into retinal cells[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(6):791-6.

[11] Zhang C S, Hawley S A , Zong Y, et al. Fructose-1,6-bisphosphate and aldolase mediate glucose sensing by AMPK[J].Nature, 2017,548(7665):112-34.

[12] 金佳麗. USP21調(diào)控小鼠胚胎干細胞自我更新及重編程的功能及其機制的研究[D]. 上海: 華東師范大學, 2017.

[12] Jin J L. The function and mechanism of USP21 regulate mouse embryonic stem cell self-renewal and reprogram[D]. Shanghai: East China Normal University, 2017.

[13] Liu H, Zhong H, Yin Y, et al. Genistein has beneficial effects on hepatic steatosis in high fat-high sucrose diet-treated rats[J].BiomedPharmacother, 2017,91:964-9.

[14] Wang J C, Xu R H, Wang R L, et al. Overexpression of ACC gene from oleaginous yeast Lipomyces starkeyi enhanced the lipid accumulation in Saccharomyces cerevisiae with increased levels of glycerol 3-phosphate substrates[J].BiosciBiotechnolBiochem, 2016,80(6):1214-22.

[15] Liu C X , Luo Z, Hu W, et al. Kinetics of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I) in Chinese sucker (Myxocyprinus asiaticus) change with its development[J].Lipids, 2014,49(2):173-81.