黃芪多糖對糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號通路的影響

李承德，王　煜，曲敬蓉，張曉俊，毛淑梅，聶　克

(1. 山東中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，山東 濟南　250355；2. 濰坊醫(yī)學院藥理學教研室，山東省重點應用藥理學實驗室，山東 濰坊　261053；3. 廣東藥科大學中藥學院中藥藥理教研室，廣東 廣州　510006)

伴隨著糖尿病(diabetes mellitus,DM)發(fā)病率的逐年升高，糖尿病腎病已成為導致終末腎病的重要原因之一[1]。目前，糖尿病腎病缺乏有效的特異性治療，臨床常用的西藥有血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等，上述藥物雖然在防治糖尿病腎病方面發(fā)揮了重要作用，但臨床上仍有大量糖尿病患者腎功能逐步惡化，故探索新的對糖尿病引起的腎損傷具有保護作用的藥物，是一項重要的醫(yī)學課題。近年研究顯示，TGF-β1/Smads信號通路在糖尿病腎病的發(fā)病過程中起重要作用，是糖尿病腎病的一個重要的可干預靶點[2]。課題組前期研究發(fā)現，中藥黃芪提取物黃芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)可減輕糖尿病大鼠早期多尿癥狀[3]。但APS對糖尿病機體腎臟TGF-β1/Smads信號通路是否具有作用，未見報道。本研究擬就上述問題進行探索，以探討APS治療糖尿病腎臟損傷的可能機制。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1實驗動物Wistar大鼠，♂，體質量(200±20)g，購于山東魯抗公司，合格證號:SCXK魯20130001。飼養(yǎng)于(24±2)℃環(huán)境，每籠5只，動物適應新實驗環(huán)境1周后開始實驗。

1.1.2藥品與試劑 APS純度為70%(惠州市東方植物保健科技有限公司)；鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)，購自美國Sigma公司；TGF-β1兔抗大鼠一抗、羊抗兔IgG(武漢博士德公司)；Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3 ELISA試劑盒購自Cell Signaling公司；Smad7、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1,TIMP-1)、TIMP-2、腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1,KIM-1)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)ELISA試劑盒購于武漢華美公司。

1.1.3儀器全自動生化分析儀(北京普朗新技術有限公司)，eTouch血糖儀(美國強生公司)，酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

1.2　方法

1.2.1模型制備及分組選擇50只健康Wistar大鼠，參照文獻報道[3]，每只大鼠腹腔注射55 mg·kg-1STZ(pH 4.5，現用現配)1次。3 d后用血糖儀檢測尾靜脈血糖，從中選擇隨機血糖≥16.7 mmol·L-1的30只大鼠納入后續(xù)實驗，并隨機分為DM組、APS低、高劑量組，每組10只。另取10只健康Wistar大鼠作為正常組。

1.2.2藥物治療分組后，APS低、高劑量組大鼠分別給予200、400 mg·kg-1·d-1的APS，灌胃給藥，每日1次，連續(xù)用藥8周。DM組與正常組大鼠給予相同體積的生理鹽水。

1.2.3血糖、血肌酐、尿素氮檢測實驗結束，稱重大鼠，血糖儀測空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)水平。頸總動脈取血，采用全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。處死大鼠后，取腎臟稱重，計算腎重/體重。

1.2.4Western blot分析實驗結束處死大鼠，取部分新鮮的腎組織，提取總蛋白，將40 μg蛋白樣品經電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜，封閉液封閉1 h，一抗(TGF-β1稀釋度為1 ∶1 000；β-actin稀釋度為1 ∶1 000)4℃過夜，洗滌3次，二抗溶液中37℃孵育2 h，顯影，定影，采用Image J進行檢測分析，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度/β-actin條帶灰度。

1.2.5ELISA檢測代謝籠收集大鼠尿液，ELISA檢測尿KIM-1、尿OPN濃度。取部分新鮮的腎組織勻漿，將勻漿液離心后保存上清液。ELISA檢測腎組織中Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad7、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2水平。

2　結果

2.1APS對大鼠血糖水平的影響如Tab 1所示，與正常組比較，DM組大鼠血糖明顯升高(P<0.05)。與DM組比較，APS低、高劑量組大鼠血糖降低(P<0.05)，且高劑量組較低劑量組有進一步下降趨勢。

2.2APS對大鼠腎損傷標志物水平的影響如Tab 1所示，與正常組比較，DM組大鼠腎重/體重、尿KIM-1、尿OPN、血肌酐、血尿素氮濃度明顯升高(P<0.05)，說明糖尿病引起了大鼠腎臟損傷。與DM組比較，APS低、高劑量組大鼠上述指標水平均明顯減低(P<0.05)，且高劑量組腎重/體重、尿KIM-1、OPN濃度明顯低于低劑量組(P<0.05)，說明APS劑量依賴性地改善了糖尿病大鼠的腎臟損傷。

2.3APS對大鼠腎臟TGF-β1水平的影響如Fig 1 Western blot結果顯示，與正常組比較，DM組大鼠腎臟TGF-β1水平明顯升高(P<0.05)。與DM組比較，APS低、高劑量組大鼠腎臟TGF-β1水平均明顯減低(P<0.05)；且高劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)，說明APS劑量依賴性地抑制了糖尿病大鼠的腎臟TGF-β1表達。

2.4APS對腎臟Smads水平的影響如Tab 2所示，與正常組比較，DM組大鼠腎臟Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3水平明顯升高(P<0.05)，而Smad7水平明顯降低(P<0.05)。與DM組比較，APS低、高劑量組大鼠腎臟Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3水平均明顯減低(P<0.05)，而Smad7水平明顯升高(P<0.05)。且APS高劑量組Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3水平低于APS低劑量組(P<0.05)，Smad7水平高于APS低劑量組(P<0.05)。

Fig 1　Expression of renal TGF-β1

#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsDM;△P<0.05vsAPS-low

2.5APS對腎臟MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2水平的影響如Tab 3顯示，與正常組比較，DM組大鼠腎臟MMP-2、MMP-9水平明顯降低(P<0.05)，而TIMP-1、TIMP-2水平明顯升高(P<0.05)。與DM組比較，APS低、高劑量組大鼠腎臟MMP-2、MMP-9水平明顯升高(P<0.05)，而TIMP-1、TIMP-2水平明顯減低(P<0.05)；且高劑量組變化較低劑量組更為明顯(P<0.05)。

3　討論

糖尿病腎病是糖尿病一種常見的并發(fā)癥，目前尚缺乏特異性的防治措施。臨床上通常在嚴格控制血糖基礎上，應用血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑等加以防治，但上述措施很難完全阻止腎功能惡化。我國傳統(tǒng)醫(yī)學在糖尿病及其并發(fā)癥的防治上發(fā)揮了重要作用，近年研究顯示一些中藥提取物可部分減輕糖尿病引起的腎損傷[4]。APS是中藥黃芪的一種提取物，資料表明，APS可緩解糖尿病動物模型的炎癥反應，改善胰島功能、降低血糖水平，改善糖尿病引起的肝臟、腎臟等臟器損傷，在糖尿病及其多種并發(fā)癥的防治上顯示了較好的療效[5]。本研究以APS治療糖尿病大鼠，發(fā)現APS可明顯降低糖尿病大鼠腎損傷標志物尿KIM-1、OPN、肌酐、尿素氮的水平，表明APS對糖尿病引起的腎損傷有保護作用，這與課題組前期發(fā)現相一致[3]。在評價腎功能損傷時，尿KIM-1、尿OPN比肌酐、尿素氮等指標更為敏感，后者通常在腎功能嚴重下降時才發(fā)生明顯變化，而尿KIM-1、尿OPN水平在腎臟存在輕微損傷時即發(fā)生明顯變化，在新近文獻中常被用來評價腎臟早期損傷[6]。

Tab 1　Effects of APS on blood glucose and renal damage(±s,n=10)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsDM;△P<0.05vsAPS-low

Tab 2　Effects of APS on renal Smads levels(±s，n=10)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsDM;△P<0.05vsAPS-low

Tab 3　Effects of APS on renal MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 levels(±s,n=10)

#P<0.05vsnormal;*P<0.05vsDM;△P<0.05vsAPS-low

糖尿病腎病的發(fā)生機制復雜， TGF-β/Smads信號通路的變化被認為與糖尿病腎病關系密切[7]。TGF-β1是TGF-β家族中一個核心成員，具有廣泛的生物學效應。如果TGF-β1表達水平過高，在腎臟它可促進成纖維細胞生長、增加細胞外基質含量，引起腎臟硬化。文獻顯示，糖尿病腎病機體腎臟TGF-β1表達異常升高，而控制其表達水平則有利于改善糖尿病引起的腎損害，是糖尿病腎病一個重要的可干預靶點[8]。本研究顯示，糖尿病大鼠腎臟TGF-β1含量較正常大鼠明顯升高，這與既往文獻報道一致[8]。而經過APS干預，糖尿病大鼠腎臟TGF-β1水平明顯下降，且APS療效呈劑量依賴性，該結果表明APS對 TGF-β1信號有抑制作用。在體內，TGF-β1作用的發(fā)揮是通過復雜的信號通路實現的，Smad分子是參與TGF-β1信號傳導的一族蛋白。Smad家族包括Smad 1、2、3、4、5、6、7、8等，其中Smad2、Smad3被認為在糖尿病腎病發(fā)病的過程中起重要作用[9]。TGF-β1與其受體結合后，募集并磷酸化Smad2、Smad3等。作為受體調節(jié)型的Smads，Smad2、Smad3被活化后與Smad4結合形成轉錄復合物，由胞質進入細胞核啟動靶基因的轉錄，最終影響一些參與腎臟損傷的分子的表達。而Smad7被認為是一種抑制型Smad，對TGF-β1信號通路有抑制作用[10]。本研究中，糖尿病大鼠腎臟Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3水平較正常大鼠明顯增高，而Smad7水平降低。與此類似，其他文獻也報道糖尿病機體腎臟等Smads表達發(fā)生變化[10-11]。而在本研究中，經過APS干預后，糖尿病大鼠腎臟Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3水平明顯降低，而Smad7水平明顯升高，且APS的作用呈劑量依賴性，說明APS明顯抑制了TGF-β1下游分子的Smad2、Smad3的表達及其活化，而同時又增加了抑制型Smad的表達。因TGF-β1/ Smads信號通路在糖尿病腎病的發(fā)病中具有重要作用，推斷APS對糖尿病大鼠腎臟的保護作用可能與調節(jié)其TGF-β1/Smads信號通路有關。除本研究發(fā)現APS對糖尿病大鼠腎臟TGF-β1/Smads信號通路具有調節(jié)作用外，黃進等[12]研究發(fā)現，APS可通過抑制大鼠TGF-β1/Smads信號通路而改善CCl4引起的肝纖維化。此外，尚有研究顯示其他一些藥物也可通過調節(jié)TGF-β1/Smads信號通路，而對糖尿病動物發(fā)揮腎臟保護作用[9,11]。

TGF-β1/Smads信號通路的最終效應是通過調控一些下游分子的表達而實現的。研究顯示MMP的表達受到TGF-β的調控[13]。MMP屬于Zn2+依賴的中性蛋白酶家族，在腎小球系膜細胞、成纖維細胞等多種細胞均有表達。在腎臟，MMP可降解膠原、分解基質，在防止腎小球硬化方面具有重要作用[14]。既往文獻顯示，當TGF-β水平增高時，糖尿病機體腎臟MMP表達通常會降低[15]。與此一致，本研究顯示糖尿病大鼠腎臟組織中MMP-2、MMP-9水平較正常組大鼠明顯降低。此外，TIMP的表達也受到是TGF-β1/Smads信號調控，TIMP具有強烈抑制MMP生物學活性的作用[14]。MMP通常以酶原的形式分泌，需要通過活化后才具有生物學活性，而TIMP可嚴重干擾MMP的活化過程，抑制MMP生物學活性的發(fā)揮。研究顯示，TIMP在正常腎組織表達較少，而患有糖尿病腎病時腎臟TIMP表達明顯升高。與既往文獻報道一致，本研究中DM組大鼠腎臟TIMP-1、TIMP-2表達較正常組大鼠明顯升高。然而，經過APS干預后，糖尿病大鼠腎組織中MMP-2、MMP-9水平明顯升高，而且TIMP-1、TIMP-2水平則明顯降低。該結果表明APS對TGF-β1/Smads信號通路的下游分子的表達具有調節(jié)作用。

綜上所述，APS對糖尿病引起的腎臟損傷具有保護作用，其保護作用可能與抑制TGF-β1/Smads信號通路有關。

(致謝：本實驗于山東省重點濰坊醫(yī)學院應用藥理學實驗室、山東中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院完成，向參與本實驗的所有實驗室研究人員致以感謝！)

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