Cdk5介導的凋亡與自噬交互作用對腦缺血的調(diào)控

劉　芳，周小江，陳乃宏,3

(1. 湖南中醫(yī)藥大學藥學院，2. 湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙　410208；3. 中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，北京　100050)

腦缺血是一類重要的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是指突發(fā)的腦組織局部供血不足或停止供血、供氧、供糖等，使該局部腦組織崩解破壞，進而產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙的一種腦血管疾病。在全球人口老齡化趨勢日益加速的環(huán)境下，腦缺血的危害日益突出，發(fā)病者約30%死亡，而70%的生存者有偏癱、失語等殘障，給家庭和社會帶來沉重負擔[1]。從缺血發(fā)生到神經(jīng)細胞死亡雖然極為短暫，但是卻需要經(jīng)歷“漫長”且“復雜”的生化代謝和細胞間信號傳遞、轉(zhuǎn)導，這個“漫長”的進程為我們提供了可能并可以被干預的機會[2]。因此，探明錯綜復雜的腦缺血損傷分子機制和其引發(fā)的信號傳導過程，尋找合適的調(diào)控腦缺血損傷后神經(jīng)元保護的作用靶點對該病的防治具有重要意義。

隨著現(xiàn)代免疫學和分子生物學的迅速發(fā)展，認為腦缺血損傷的病理生理機制是一個快速級聯(lián)反應過程[3]，包括能量障礙、神經(jīng)興奮性毒性、腦內(nèi)炎癥和程序性細胞死亡等多種分子、細胞事件，其中程序性細胞死亡包括凋亡和自噬兩種途徑。腦缺血一旦發(fā)生，腦內(nèi)能量將很快被耗竭，神經(jīng)細胞程序性死亡迅速發(fā)生，凋亡和自噬途徑被激活[4]，并參與神經(jīng)元的損傷過程，具體調(diào)控機制受到科研工作者們的廣泛關(guān)注。本文將重點討論細胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent protein kinase 5, Cdk5)介導的凋亡與自噬交互作用對腦缺血進程的調(diào)控。

1　Cdk5介導的凋亡與自噬對腦缺血的調(diào)控

Cdk5作為一種主要在神經(jīng)元內(nèi)表達的脯氨酸限定的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)控神經(jīng)元分化、皮質(zhì)的形成、神經(jīng)元細胞的遷移和神經(jīng)軸突的生長過程中至關(guān)重要，具有潛在的調(diào)控神經(jīng)元功能[5]。1999年，Patrick等[6]發(fā)現(xiàn)p35在鈣激活性蛋白酶水解作用下裂解成p25，繼而導致Cdk5長期連續(xù)不可調(diào)控性激活，從而加速神經(jīng)元損傷。由于Cdk5廣泛且復雜的生理作用，部分腦缺血病的研究者們也一直關(guān)注Cdk5，如采用局限性腦缺血模型和缺氧處理的神經(jīng)細胞模型等進行研究，發(fā)現(xiàn)Cdk5活性和p25表達增加與海馬神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)[7]。最新研究亦表明[8-9]，采用Cdk5抑制劑能降低局灶性缺血新生大鼠中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (caspase-3)的表達、成年缺血性中風大鼠模型中的細胞凋亡率，進一步證實了Cdk5信號通路對腦缺血后神經(jīng)元凋亡調(diào)控的關(guān)鍵作用。本課題組前期研究在局灶性腦缺血大鼠模型中，同樣發(fā)現(xiàn)Cdk5表達異常，證實了Cdk5信號途徑對腦缺血后神經(jīng)元凋亡調(diào)控的重要性[10]，且最近研究結(jié)果表明，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2的表達也相應增加，提示腦缺血后神經(jīng)細胞的凋亡與Cdk5的異?；罨哂幸欢ǖ年P(guān)聯(lián)性。

由于缺血性腦損傷的原發(fā)性和繼發(fā)性分子機制十分復雜，凋亡并非決定細胞死亡命運的唯一途徑，腦缺血還能激活Ⅱ型程序性細胞死亡途徑——自噬，它是一種細胞利用自身溶酶體途徑降解細胞生物大分子、細胞器或病原微生物的過程[11]。近年研究表明，在神經(jīng)退行性疾病中Cdk5與自噬間也具有關(guān)聯(lián)性，如Su等[12]發(fā)現(xiàn)Cdk5的異?；罨瘜⒄T導自噬活性增加，從而加重神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導的神經(jīng)毒性和突觸核蛋白的聚集，采用Cdk5抑制劑則可有效阻斷這一途徑；Cdk5還可通過磷酸化多種底物，如介導Raf激酶抑制劑蛋白的磷酸化[13]和吞蛋白B1磷酸化[14]，或通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑有效調(diào)控神經(jīng)元死亡[15]，證實了Cdk5是自噬發(fā)生的關(guān)鍵調(diào)控子，且其底物具有多樣性。綜上，Cdk5作為神經(jīng)元調(diào)控的關(guān)鍵上游蛋白，對凋亡和自噬均具有重要意義。

2　凋亡與自噬及其交互作用對腦缺血的調(diào)控

盡管自噬與凋亡在代謝途徑和形態(tài)學方面存在明顯區(qū)別，但它們的信號通路卻有著千絲萬縷的聯(lián)系，二者之間存在多種信號交互方式，如合作、對抗、協(xié)作等[16]。合作方式表現(xiàn)為二者的調(diào)控目標都是促進細胞死亡；對抗關(guān)系中，二者的目標及過程背道而馳，自噬并不引發(fā)細胞死亡，相反促進細胞存活。無論何種關(guān)系，凋亡與自噬之間必須通過二者的共享調(diào)節(jié)子如Bcl-2家族蛋白、caspase等進行搭橋串話，雙向調(diào)節(jié)。大量研究報道了凋亡與自噬對腦缺血的調(diào)控。然而，因?qū)嶒炠Y料的不同，尚存在兩種不同的觀點：① 激活自噬加速神經(jīng)元的凋亡[17-18]。研究者們通過對自噬標志性蛋白LC3- II/Beclin-1的研究發(fā)現(xiàn)，自噬的激活可提高凋亡因子caspase-9活性而加劇神經(jīng)元凋亡程度；而采用LC3- II/Beclin-1蛋白抑制劑干預后，能抑制細胞凋亡。② 激活自噬可抑制神經(jīng)元凋亡，防止腦損傷[19-20]。研究者們發(fā)現(xiàn)藥物發(fā)揮神經(jīng)保護作用的主要途徑是通過上調(diào)LC3- II和Beclin-1激活自噬，而凋亡蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP)、Bcl-2/Bax則表達下調(diào)，自噬誘導劑可增加藥物對腦缺血損傷的保護作用；自噬抑制劑則加劇凋亡的發(fā)生。無論何種觀點，腦缺血過程中凋亡和自噬的交互作用將對神經(jīng)元產(chǎn)生調(diào)控是不爭的事實，故二者的相互作用網(wǎng)絡研究將為腦缺血后神經(jīng)細胞的死亡途徑提供更加詳實的證據(jù)。

3　Cdk5介導的凋亡與自噬交互網(wǎng)絡

磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)是自噬膜形成和成熟的關(guān)鍵信號通路[11]，其中，Akt作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，除了通過mTOR對自噬具有調(diào)控作用外，還能影響下游多種凋亡相關(guān)因子的活化狀態(tài)，根據(jù)文獻報道[21-22]歸納為3條信號傳導途徑：① Akt激酶通過使Bad的Ser136位點磷酸化, 阻斷Bad與Bcl-2和/或Bcl-xl形成二聚體，有效阻斷細胞凋亡；② Akt磷酸化Bcl-2家族成員Bax的Ser184位點, 負調(diào)控促凋亡功能；③ 活化的Akt還可以使caspase-9在Ser196 位點磷酸化而失活, 從而抑制caspase-3，有效抑制凋亡。3種途徑均表明Akt是凋亡與自噬共享調(diào)節(jié)子關(guān)鍵上游蛋白。此外，研究表明[23]，Cdk5可通過調(diào)節(jié)Akt激酶的活化水平，進而影響下游相關(guān)蛋白的表達，證實了Cdk5與Akt之間存在信號轉(zhuǎn)導關(guān)系；Cdk5還能影響caspase-3和Bcl-2的表達水平，進而調(diào)控凋亡[8-9]，而Bcl-2又可與自噬的關(guān)鍵基因Beclin-1結(jié)合直接調(diào)控自噬[24]，通過Bcl-2在Ser70位點磷酸化，導致Bcl-2/Beclin1復合物降解，激活自噬，而采用Akt激酶抑制劑則可通過降低Bcl-2的磷酸化水平，從而降低自噬水平。綜上，推測Cdk5經(jīng)由Akt激酶調(diào)節(jié)凋亡與自噬的共享調(diào)節(jié)子，進而調(diào)控二者的交互作用網(wǎng)絡，對腦缺血后神經(jīng)元發(fā)揮雙重調(diào)節(jié)作用，具體信號途徑見Fig 1。

4　展望

由于腦缺血的病理生理機制的復雜性，且隨著腦缺血的進程發(fā)生變化，因此，有關(guān)腦缺血后Cdk5介導的凋亡與自噬之間的交互作用到底如何？自噬對腦缺血后神經(jīng)細胞元凋亡是產(chǎn)生正向調(diào)控還是負向調(diào)控？這些問題答案并非一成不變，腦缺血過程必須動態(tài)研究才能更加真實地反映其分子機制。在前期研究基礎(chǔ)和充分的文獻調(diào)研基礎(chǔ)上，基于Cdk5對神經(jīng)元調(diào)控的關(guān)鍵性，針對凋亡與自噬的交互作用方式在腦缺血調(diào)控中存在的不同觀點，推測Cdk5介導的凋亡與自噬交互作用對腦缺血進程的調(diào)控可能如下：① 腦缺血初期，Cdk5通過Akt激酶介導凋亡與自噬的產(chǎn)生，二者以合作的形式共同清除受損細胞器，維持細胞正常功能。② 隨著腦缺血的進程，Cdk5異?；罨?，Akt激酶活性被抑制，導致Akt對細胞凋亡的抑制作用通過凋亡與自噬的共享調(diào)節(jié)子被阻斷；同時，Akt的活性降低直接導致mTOR被激活，從而抑制自噬。此時，凋亡與自噬的交互作用形式表現(xiàn)為對抗關(guān)系，自噬并不引發(fā)細胞死亡，相反促進細胞存活，但是由于腦缺血加劇期自噬活性的降低導致神經(jīng)元持續(xù)大規(guī)模死亡。后續(xù)本課題組將以此為方向展開深入研究，為缺血性腦損傷治療靶點的尋找提供有價值的線索。此外，課題組前期分別從體外和體內(nèi)兩個角度，采用體外氧化應激細胞模型和體內(nèi)局灶性腦缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)證實了補陽還五湯類方對腦缺血損傷療效明顯[10,25]，據(jù)本文思路，推測補陽還五湯類方可能通過對凋亡與自噬的共享調(diào)節(jié)子如Bax、Bcl-2家族蛋白和caspase等途徑，對腦缺血后神經(jīng)元的自噬和凋亡產(chǎn)生干預，恢復機體內(nèi)陰陽平衡，有效發(fā)揮抗腦缺血損傷作用，將從新的視角闡明補陽還五湯類方抗腦缺血作用機制，并有望在此基礎(chǔ)上進行創(chuàng)新藥物研發(fā)。

Fig 1　Intercross effect of apoptosis and autophagy mediated by Cdk5

(致謝：本文研究思路的形成得到了湖南中醫(yī)藥大學裴剛教授的大力指點，在此表示感謝。)

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