基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的芪參顆粒干預(yù)過(guò)量異丙腎上腺素誘導(dǎo)小鼠心力衰竭的機(jī)制研究

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心力衰竭為各種心臟疾病的嚴(yán)重階段，隨著高血壓、冠心病等心血管疾病發(fā)病率的增加，最終發(fā)展為心力衰竭的人群也逐漸增多[1]。雖然西醫(yī)治療慢性心力衰竭已取得進(jìn)展，但存在副作用較大、應(yīng)用禁忌等問(wèn)題。中醫(yī)藥具有副作用小及組方靈活等優(yōu)勢(shì)，在治療慢性心力衰竭方面發(fā)揮重要作用，值得進(jìn)一步深入研究。芪參顆粒是研究團(tuán)隊(duì)臨床長(zhǎng)期應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)方，由黃芪、丹參、金銀花、甘草等藥味組成，適于心力衰竭陽(yáng)(氣)虧虛、瘀“毒”內(nèi)阻證，具有“簡(jiǎn)效驗(yàn)廉”的優(yōu)勢(shì)。課題組前期研究表明芪參顆粒對(duì)心肌缺血所致心力衰竭模型具有改善心功能、延緩心室重構(gòu)的作用[2-3]，但其物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制尚未完全闡明。心力衰竭的病理生理機(jī)制復(fù)雜，交感系統(tǒng)過(guò)度激活是其重要機(jī)制之一。芪參顆粒是否通過(guò)調(diào)節(jié)交感系統(tǒng)活性治療心力衰竭，是否對(duì)交感系統(tǒng)過(guò)度激活導(dǎo)致的心力衰竭有效？為了解答上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)擬觀察芪參顆粒干預(yù)過(guò)量異丙腎上腺素致小鼠心力衰竭的療效，并采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步闡明芪參顆粒作用特點(diǎn)及機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康C57BL雄性小鼠24只，體重20 g±1 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，恒溫、恒濕，自由飲水，普通飼料。

1.2藥物與試劑芪參顆粒由黃芪、丹參、金銀花、甘草等中藥組成，各藥材飲片均購(gòu)于北京同仁堂制藥有限公司，按照課題組前期建立的方法制備[4]。福辛普利(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19980197)由中美上海施貴寶制藥有限公司提供。異丙腎上腺素(批號(hào)：101722747)由西格瑪-奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司提供。

1.3儀器與材料加拿大VisualSonics公司高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)Vevo 2100，配有30 MHz探頭；1 mL注射器、小鼠灌胃針、1.5 mL離心管、1.0 mL凍存管等。

1.4網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)在線中醫(yī)藥生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM)[5]。

1.5方法

1.5.1分組與造模小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機(jī)分為模型組、空白組、芪參顆粒組、福辛普利組。心力衰竭模型制作采用本研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)典的鹽酸異丙腎上腺素梯度造模法：第1日20 mg/kg，第2日10 mg/kg，第3日～第14日 5 mg/kg給予小鼠皮下注射異丙腎上腺素[6]。給藥組和模型組按上述方案，皮下注射異丙腎上腺素?？瞻捉M皮下注射生理鹽水，每日1次，連續(xù)14 d。從造模即日起，福辛普利組每日予福辛普利5.5 mg/kg，芪參顆粒組每日予芪參顆粒44 g/kg(以生藥量計(jì))；模型組與空白組動(dòng)物給予同體積純凈水。連續(xù)給藥14 d。

1.5.2小鼠心臟超聲檢測(cè)實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，采用VisualSonics Vevo 2100小動(dòng)物高分辨率顯微超聲成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)各組實(shí)驗(yàn)小鼠的心臟結(jié)構(gòu)及功能，測(cè)量左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular internal systolic diameter，LVIDs)、左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)，計(jì)算射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)和短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)。每只動(dòng)物采樣3次，記錄3個(gè)心動(dòng)周期的平均值用于后續(xù)分析。

1.5.3心臟指數(shù)計(jì)算實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，測(cè)量小鼠體質(zhì)量。小鼠腹腔麻醉、處死后，迅速開胸，摘取心臟，用預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)沖洗心腔血塊，剪除心臟周圍結(jié)締組織和血管，稱取心臟重量，計(jì)算心臟指數(shù)。心臟指數(shù)=心質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.5.4病理學(xué)檢測(cè)心臟組織采用4%多聚甲醛固定，常規(guī)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察并記錄病變情況。

1.5.5網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析在BATMAN-TCM在線網(wǎng)站鍵入芪參顆粒的組方中藥，得到藥物治療疾病與靶點(diǎn)交互數(shù)據(jù)集。

2　結(jié)　果

2.1各組小鼠心功能比較造模后14 d，與空白組比較，模型組LVIDs、LVIDd顯著增加(P<0.05)，EF和FS顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，芪參顆粒組心力衰竭小鼠心室LVIDs顯著降低(P<0.05)，有降低LVIDd趨勢(shì)(P=0.05)，EF與FS提高(P<0.05)。與模型組比較，福辛普利心力衰竭小鼠LVIDd差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，EF值與FS值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可見(jiàn)，芪參顆粒治療過(guò)量異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心力衰竭可能較福辛普利更顯著。詳見(jiàn)表1。

表1　各組小鼠心功能比較(±s)

2.2心臟指數(shù)與空白組比較，模型組心臟指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，芪參顆粒組可有效降低心力衰竭小鼠心臟指數(shù)(P<0.05)，與陽(yáng)性對(duì)照藥福辛普利作用相近。詳見(jiàn)圖1。

2.3病理學(xué)檢測(cè)HE染色結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物心肌組織血管管腔、管徑增大，血管壁增厚，伴有壁外側(cè)結(jié)締組織增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，芪參顆粒組動(dòng)物心肌組織的病變程度顯著減輕。福辛普利組也有類似的改善作用。詳見(jiàn)圖2。

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

圖1芪參顆粒對(duì)ISO致心力衰竭小鼠心臟指數(shù)的影響

圖2心肌組織HE染色病理學(xué)圖

2.4芪參顆粒治療心力衰竭的靶標(biāo)預(yù)測(cè)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法，引入中藥復(fù)方治療心血管疾病中，為研究中藥復(fù)方治療心血管等復(fù)雜疾病的藥理學(xué)機(jī)制和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)提供高通量數(shù)據(jù)。檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，芪參顆粒治療心力衰竭的靶點(diǎn)共15個(gè)，芪參顆粒治療心力衰竭前10位對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，與心力衰竭經(jīng)典通路基本吻合。詳見(jiàn)表3。

3　討　論

異丙腎上腺素能增強(qiáng)心肌收縮力，模擬壓力超負(fù)荷型心力衰竭，具有無(wú)創(chuàng)、安全性高、均一性好的優(yōu)勢(shì)，在目前心力衰竭動(dòng)物模型中得到廣泛使用。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)芪參顆粒可改善異丙腎上腺素致心力衰竭小鼠的心功能，尤其在延緩心力衰竭進(jìn)程中以心室擴(kuò)大為主要表現(xiàn)的心肌重塑，能有效減少LVIDs和LVIDd，提示芪參顆粒對(duì)交感系統(tǒng)過(guò)度激活引起的心力衰竭有較好療效，調(diào)節(jié)交感系統(tǒng)可能是其作用機(jī)制之一。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法觀察芪參顆粒治療疾病的分布情況，將其與相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接，并根據(jù)疾病與靶點(diǎn)的相關(guān)性推測(cè)芪參顆粒治療心力衰竭可能的機(jī)制。計(jì)算結(jié)果表明，芪參顆粒治療慢性心力衰竭的作用機(jī)制靶點(diǎn)包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)、α2型腎上腺素受體(α2-AR)、1型血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體、腫瘤壞死因子(TNF)等。AngⅡ降低，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活性、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)、抑制TNF等炎癥介質(zhì)生物合成，改善心功能、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)等重要作用環(huán)節(jié)。

RAS過(guò)度激活是心力衰竭發(fā)病的啟動(dòng)環(huán)節(jié)，因此已成為心力衰竭治療的主要靶點(diǎn)[7]。ACE作為RAS的核心酶 ，催化產(chǎn)生RAS關(guān)鍵的效應(yīng)因子AngⅡ，發(fā)揮血管收縮、細(xì)胞增殖、促進(jìn)心肌重構(gòu)的作用。AGTR1為1型AngⅡ受體，1型受體認(rèn)為是調(diào)解AngⅡ的主要心血管效應(yīng)[8]。

α2-AR包括3個(gè)高度同源的亞型：alpha 2A 、alpha 2B、alpha 2C[9]。α2-AR通過(guò)識(shí)別并選擇性地與兒茶酚胺類物質(zhì)特異性結(jié)合，引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活，調(diào)節(jié)多種生理和藥理反應(yīng)。交感神經(jīng)系統(tǒng)和兒茶酚胺類物質(zhì)對(duì)維持心臟生理功能及血壓穩(wěn)態(tài)具有重要作用[10]。此外，α2-AR與其相連的胞內(nèi)效應(yīng)器調(diào)節(jié)異?？蓪?dǎo)致某些心血管疾病的發(fā)生，如心力衰竭、心絞痛、心律失常等。

TNF是一個(gè)由巨噬細(xì)胞分泌多功能促炎細(xì)胞因子，其主要通過(guò)其受體TNFRSF1A、TNFRSF1B廣泛參與規(guī)定的生物過(guò)程。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TNF是心力衰竭發(fā)生及發(fā)展的重要介質(zhì)，其作用包括抑制心肌收縮功能，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，引起心臟重構(gòu)，從而導(dǎo)致心功能失調(diào)與惡化[11]。 因此，芪參顆粒干預(yù)心力衰竭機(jī)制可能與使AngⅡ降低，抑制RAS活性、調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)、抑制TNF等炎癥介質(zhì)生物合成等有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果提示其治療心力衰竭的作用靶點(diǎn)可能還包括ATP1A1、AVP、GUCY1B3等，體現(xiàn)中藥復(fù)方多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥有效成分的篩選及效應(yīng)機(jī)制的研究開辟一條高通量途徑，為新藥研發(fā)及機(jī)制探討提供新的研究思路。但目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)仍處于起步發(fā)展階段，其研究手段計(jì)算方法及應(yīng)用軟件開發(fā)有待于完善，基于大數(shù)據(jù)和算法構(gòu)建的分子網(wǎng)絡(luò)及藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[12]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理、經(jīng)典藥理相結(jié)合研究路徑研究中藥復(fù)方的藥效靶點(diǎn)，為探索中藥多靶點(diǎn)治療病癥的機(jī)制研究提供方法學(xué)參考，但其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表3　芪參顆粒治療心力衰竭對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)(Top10)

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