原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥的核磁共振代謝組學(xué)研究

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原發(fā)性高血壓及高尿酸血癥均為危害人民健康的常見疾病。據(jù)統(tǒng)計，目前我國的高血壓病人約有2億人，大概占全球高血壓總?cè)藬?shù)的20%[1]，其中原發(fā)性高血壓占高血壓的90%以上。尿酸是人體嘌呤代謝的終產(chǎn)物，高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)是機體嘌呤代謝紊亂的結(jié)果。我國高尿酸血癥的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，根據(jù)近年各項調(diào)查研究顯示，目前約有高尿酸血癥病人1.2億人，近年來逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢[2]。心血管流行病學(xué)調(diào)查表明，血尿酸是高血壓發(fā)病的獨立危險因素，血尿酸每增加59.5 μmol/L，高血壓相對增加25%的發(fā)病風(fēng)險[3]。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新學(xué)科，作為“后基因組學(xué)”時期發(fā)展迅速的“組學(xué)”技術(shù)之一，與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)共同構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)(systems biology)的主體[4]。代謝組學(xué)通過檢測和量化生物體代謝隨時間變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)與疾病密切相關(guān)的異常代謝途徑和生物標記物，為進一步闡明疾病的發(fā)病機制提供證據(jù)。

目前代謝組學(xué)方法因其在疾病診斷及發(fā)病機制中的巨大潛力，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，成為闡釋生命奧秘和解釋病機的新手段。核磁共振技術(shù)特別是氫譜核磁共振代謝組學(xué)(1H-NMR)因其對含氫代謝物的普適性成為代謝組學(xué)主要的分析工具[5]。

高血壓及高尿酸血癥作為代謝性疾病，利用代謝組學(xué)方法對其代謝產(chǎn)物進行分析，得出血清代謝輪廓的變化，一次性獲得較完整的代謝信息，從整體上了解疾病的發(fā)病機制。

1　資料與方法

1.1研究對象依照《中國高血壓防治指南2010》[1]和《2011年無癥狀高尿酸血癥合并心血管疾病診治建議中國專家共識》[2]的診斷標準，選取2014年5月—2014年11月青島市海慈醫(yī)療集團干部保健科及青島市北區(qū)瑞良康社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站的體檢人員30名。根據(jù)體檢結(jié)果分為3組，單純高尿酸血癥組(A組)12例，年齡51.52歲±9.68歲；原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥組(B組)11例，年齡52.63歲±10.75歲；健康對照組(C組)7名，年齡41.65歲±10.26歲。高尿酸血癥組排除高血壓、高脂血癥、糖尿病等其他慢性非傳染性疾病。

1.2儀器與試劑高分辨核磁共振波譜儀：Bruker AVANCEⅢ 600 MHz、重水(D2O，99.9%氘代)、磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)和磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、核磁管由中科院青島生物能源與過程研究所提供。多功能管架自動平衡離心機、冰柜、乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管、試管架等均由青島市海慈醫(yī)療集團檢驗科提供。

1.3方法

1.3.1血清樣本采集所有研究對象釆血前要求空腹8 h，抽取清晨肘靜脈血3 mL，置入EDTA抗凝管中，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，之后取上清約0.6 mL，將其置于-80 ℃的冰柜中保存。

1.3.2樣品配制采用D2O配制生理鹽水緩沖液(K2HPO4/NaH2PO4，45 mmol/L，pH=7.4)。使用微量移液注射器取200 μL血清與等量緩沖液混合，震蕩混勻后將混合液移至核磁管中待檢。

1.3.31H-NMR實驗核磁實驗脈沖為CPMUPR1D，采集血漿樣品的數(shù)據(jù)，掃描128次，空掃16次，配備5 mm HCN三共振超低溫探頭，實驗溫度298 K。

1.3.4數(shù)據(jù)預(yù)處理使用Mest Re Nova軟件(V7.0)對所有一維1H NMR譜圖的FID信號進行傅立葉變換，所有譜圖在進行傅立葉變換時均乘以增寬因子為1 Hz的指數(shù)窗函數(shù)以提高信噪比，之后進行相位、基線校正和譜峰對齊。譜圖采用α-葡萄糖低場處的雙峰定標(δ 5.23)。利用相關(guān)軟件將核磁共振譜圖進行積分，去掉殘余水峰信號(5.19 ppm～4.50 ppm)，尿素(6.00 ppm～5.50 ppm)及外源EDTA及其與離子絡(luò)合信號(2.55 ppm～2.74 ppm，3.05 ppm～3.31 ppm，3.61 ppm～3.66 ppm)，其余區(qū)間在10.0 ppm～10.5 ppm的信號，以積分間距為0.005 ppm進行積分，將積分后的數(shù)據(jù)歸一化后進行多變量數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

1.4數(shù)據(jù)分析使用SIMCA-P+(V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden)軟件對歸一化后(PCA)的數(shù)據(jù)進行模式識別多變量數(shù)據(jù)分析，主成分分析使用中心化換算(mean center scaling)的數(shù)據(jù)標準化方式。使用SIMCA-P+軟件對歸一化后的數(shù)據(jù)進行偏最小二乘法(PLS)發(fā)現(xiàn)NMR數(shù)據(jù)(X變量)和其他變量(Y變量，分組信息)之間的相關(guān)關(guān)系。偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)使用自適換算(unit variance scaling)的數(shù)據(jù)標準化方式。PLS-DA對模型的質(zhì)量用交叉驗證法進行檢驗，并用交叉驗證后得到的R2X和Q2(分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測度)對模型有效性進行評判。在此之后，通過排列試驗隨機多次(n=200)改變分類變量y的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機Q2值對模型有效性做進一步的檢驗。

2　結(jié)　果

2.11H-NMR譜圖選擇各組中具有代表性譜圖，根據(jù)一維譜圖并結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫(HMDB)對采集到的核磁共振信號進行歸屬。詳見圖1。圖中， Keys：3-HB：3-Hydroxybutyrate；Val：Valine；Leu：Leucine；Ile：Isoleucine；Lys：Lysine；Arg：Arginine；Glu：Glutamate；Gln：Glutamine；Pyr：Pyruvate。

2.2PCA結(jié)果

2.2.1總體PCA分析(見圖2)R2X=84.3%，Q2=0.800。

δ0.50～5.6和δ5.6～9.0(縱向放大512倍)

圖1各組代表性樣品的1H 600 MHz核磁共振圖譜

圖2所有樣本的2D PCA得分圖

2.2.2A組與B組的PCA分析(見圖3)R2X=82.9%，Q2=0.777。

圖3　A組與B組的PCA得分圖

圖4B組與C組的PCA得分圖

2.2.3B組與C組的PCA分析(見圖4)R2X=85.8%，Q2=0.753。

2.2.4A組與C組的PCA分析(見圖5)R2X=83.3%，Q2=0.769。

圖5　 A組與C組的PCA得分圖

2.3PLS-DA及模型驗證

2.3.1A組與B組的PLS-DA分析(見圖6)R2X=33.3%，R2Y=0.900，Q2=0.719，截距：R2(0，0.666)，Q2(0.0，-0.276)。

圖6A組與B組的PLS-DA得分圖與排列試驗驗證結(jié)果

2.3.2B組與C組的PLS-DA分析(見圖7)R2X=40.7%，R2Y=0.993，Q2=0.961，截距：R2(0.0，0.621)，Q2(0.0，-0.245)。

圖7B組與C組的PLS-DA得分圖與排列試驗驗證結(jié)果

2.3.3A組與C組的PLS-DA分析(見圖8)R2X=33.7%，R2Y=0.958，Q2=0.801，截距：R2=(0，0.679)，Q2=(0，-0.316)。

圖8　A組與C組的PLS-DA得分圖與排列試驗驗證結(jié)果

2.4正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對PLS-DA模型進行正交信號矯正，使用SIMCA-P+軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)，尋找對分組貢獻較大的譜峰信號及其相應(yīng)代謝物。OPLS-DA使用自適換算的數(shù)據(jù)標準化方式。

2.4.1A組與B組的OPLS-DA分析(見圖9)

圖9A組與B組的OPLS-DA得分圖與相關(guān)系數(shù)負載圖

2.4.2B組與C組的OPLS-DA分析(見圖10)

圖10　B組與C組的OPLS-DA得分圖與相關(guān)系數(shù)負載圖

2.4.3A組與C組的OPLS-DA分析(見圖11)

圖11　A組與C組的OPLS-DA得分圖與相關(guān)系數(shù)負載圖

2.5差異代謝物的篩選及鑒定通過分析各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)，對有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝物進行進一步歸納，之后與相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)臨界值表進行比較，得到引起組間差異的代謝物。將A、B、C 3組間有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝物進行鑒定，并將其相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)進行歸納。根據(jù)P<0.05確定相關(guān)系數(shù)，│r│>0.707作為臨界值，小于此系數(shù)忽略不計。詳見表1～表3。

表1　A組與B組之間對分組貢獻較大的顯著性差異譜峰信號和相應(yīng)代謝物及其相關(guān)系數(shù)

表2　B組與C組之間對分組貢獻較大的顯著性差異譜峰信號和相應(yīng)代謝物及其相關(guān)系數(shù)

表3　A組與C組之間對分組貢獻較大的顯著性差異譜峰信號和相應(yīng)代謝物及其相關(guān)系數(shù)

3　討　論

本研究從1H-NMR譜圖中看出，3組代謝物多為葡萄糖、氨基酸、脂類等小分子物質(zhì)，選取的A組典型樣本中的小分子物質(zhì)主要為：組氨酸、酪氨酸、α-葡萄糖、β-葡萄糖、三酰甘油、肌酸、O-乙酰-糖蛋白、醋酸鹽、賴氨酸、脂質(zhì)(-CH2)、3-羥基丁酸；B組典型樣本中的小分子物質(zhì)為：甲酸、脫氧胞苷、胞苷、不飽和脂肪酸、乳酸、天冬氨酸、N-乙酰-糖蛋白、谷氨酰胺、CH2C=C、精氨酸、脂質(zhì)(-CH3)；C組典型樣本中的小分子物質(zhì)為：苯丙氨酸、延胡索酸鹽、尿素氮、丙酮酸鹽、乙酰乙酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。

所有組別的PCA得分圖顯示，3組樣本之間的聚類現(xiàn)象明顯，說明3組之間的代謝差異有統(tǒng)計學(xué)意義。C組樣本點的分布相對集中，反映C組個體之間的差異較小。A組與B組之間的樣品分布相對分散，反映A組與B組樣本之間的個體差異相對較大。之后分別對A組與B組，B組與C組，A組與C組樣本之間的代謝物進行PCA兩兩分析。A組與B組，B組與C組，A組與C組的PCA得分圖顯示，以模型的可解釋指標R2X和可預(yù)測指標Q2提示，所建立的數(shù)學(xué)模型比較可靠，組間的聚類現(xiàn)象比較明顯，說明A組與B組，B組與C組，A組與C組之間代謝物差異顯著。

A組與B組，B組與C組，A組與C組的PLS-DA得分圖和排列試驗驗證結(jié)果，以模型的可解釋指標R2X和可預(yù)測指標Q2，并結(jié)合排列試驗驗證結(jié)果共同提示，所建立的數(shù)學(xué)模型較可靠，說明組間代謝組差異比較顯著。對PLS-DA模型進行正交信號矯正，通過OPLS-DA尋找對分組貢獻較大的譜峰信號及其相應(yīng)代謝物。這些代謝物涉及的代謝途徑主要與脂類代謝、氨基酸代謝和糖代謝相關(guān)。

3.1脂類代謝異常脂質(zhì)(-CH3)、脂質(zhì)(-CH2)、CH2CH2CO、不飽和脂肪酸、三酰甘油屬于脂類代謝途徑產(chǎn)物。有研究顯示：三酰甘油水平升高與慢性腎炎發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系[3]。有報道三酰甘油含量升高可能成為冠心病發(fā)生發(fā)展變化的獨立危險因素[6]。

酮體是脂肪分解的產(chǎn)物，糖代謝障礙和脂肪不完全氧化時酮體在體內(nèi)積聚使血酮升高。乙酰乙酸是酮體的組成部分，3-羥基丁酸等酮體水平升高，表明脂肪酸氧化的增強。

不飽和脂類水平的提高可能與脂蛋白脂肪酶活力降低有關(guān)，還可能與炎癥過程有關(guān)，如一些聚-不飽和脂肪酸是炎癥介質(zhì)(如白細胞三烯和前列腺素)的前體。

差異代謝物篩選結(jié)果顯示，原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人的脂質(zhì)(-CH3)、脂質(zhì)(-CH2)、CH2CH2CO、不飽和脂肪酸、三酰甘油含量較單純高尿酸血癥組高；原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥較健康對照組脂質(zhì)(-CH3)、脂質(zhì)(-CH2)、CH2CH2CO、CH2C=C、不飽和脂肪酸、三酰甘油含量偏高；高尿酸血癥組較健康對照組脂質(zhì)(-CH3)、脂質(zhì)(-CH2)、不飽和脂肪酸、三酰甘油含量偏高。

原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人較單純高尿酸血癥病人、原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人較健康人、單純高尿酸血癥病人較健康人的脂代謝紊亂更嚴重。

3.2氨基酸代謝異常纈氨酸、丙氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺屬于氨基酸代謝途徑產(chǎn)物。纈氨酸屬于支鏈氨基酸，反映機體合成代謝的重要因素。丙氨酸在肌肉組織濃度最高，是主要的能量來源，是淋巴細胞再生與免疫系統(tǒng)的重要氨基酸，是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。當(dāng)支鏈氨基酸缺乏時，血漿丙氨酸濃度降低。組氨酸經(jīng)過一定途徑轉(zhuǎn)化為酮戊二酸，再經(jīng)糖異生途徑生成糖或轉(zhuǎn)變成甘油。酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其代謝受α-酮戊二酸脫氧酵活性的影響，因此，當(dāng)機體處于病理狀態(tài)時，酶的活性降低，產(chǎn)物含量減少。

苯丙氨酸和酪氨酸結(jié)構(gòu)相似，均屬于芳香族氨基酸。苯丙氨酸在體內(nèi)經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化生成酪氨酸，之后再生成一系列代謝產(chǎn)物，一般認為苯丙氨酸輕度增高對機體無特殊影響。酪氨酸進一步代謝涉及某些神經(jīng)遞質(zhì)、激素及黑色素合成，在清除自由基、延緩疲勞等方面均有積極作用。天冬氨酸是賴氨酸、蘇氨酸合成的物質(zhì)之一，具有降低氧消耗作用，對心肌有保護作用。天冬氨酸參與鳥氨酸循環(huán)，可降低血液氮和二氧化碳含量，具有增強肝臟功能、消除疲勞的作用，本研究高尿酸血癥病人較健康對照人含量增多，可能是一種應(yīng)激情況下的反應(yīng)。谷氨酰胺參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝途徑，谷氨酰胺是體內(nèi)重要抗氧化劑谷胱甘肽的前體[7]。

N-乙酞-糖蛋白如血清淀粉樣蛋白(apoSAA)和C-反應(yīng)蛋白(CRP)是炎癥標記物和急性期反應(yīng)物蛋白[4]。原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人較單純高尿酸血癥病人酪氨酸、組氨酸、苯丙氨酸含量升高，纈氨酸、丙氨酸含量降低。原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人較健康人纈氨酸、丙氨酸、O-乙酰-糖蛋白、組氨酸、苯丙氨酸含量降低。單純高尿酸血癥病人較健康人N-乙酰-糖蛋白、酪氨酸含量降低，丙氨酸、天冬氨酸含量升高。說明原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人與單純高尿酸血癥病人均存在氨基酸代謝紊亂，提示氨基酸代謝紊亂可能參與高血壓合并高尿酸血癥的發(fā)生。

有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，血漿游離氨基酸失衡與高血壓發(fā)生存在一定關(guān)系，通過與正常人比較，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸升高，它們屬于必需氨基酸；非必需氨基酸中，精氨酸、丙氨酸升高，而?；撬岚彼?、甘氨酸、絲氨酸、谷氨酸、氨酸、羥脯氨酸則低于正常人[5]，得出的結(jié)論與本研究發(fā)現(xiàn)的代謝譜結(jié)果相近，但氨基酸變化情況不同，可能與本研究樣本量小有關(guān)，需要進一步研究分析，得出全面可靠的結(jié)論。

3.3糖類代謝異常在糖代謝方面，乳酸是糖酵解產(chǎn)物，其代謝異常是能量代謝紊亂的標志。正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)的糖分解速度較慢，產(chǎn)生的丙酮酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)較少，當(dāng)人處于缺氧或劇烈運動時，細胞供氧不足，線粒體內(nèi)丙酮酸和NADH的氧化分解過程。缺氧是引起乳酸增加的重要原因。

肌酸是一種自然存在體內(nèi)的一種含氮有機酸，可輔助為肌肉和神經(jīng)細胞提供能量。肌酸-磷酸肌酸系統(tǒng)是細胞能量運輸?shù)年P(guān)鍵[8]，肌酸水平下降認為是能量代謝紊亂的標志。

丙氨酸具有協(xié)助葡萄糖代謝，改善低血糖，維持血糖的正常水平，達到改善身體能量的作用，丙氨酸偏低說明體內(nèi)糖異生的途徑受到限制。

醋酸鹽參與糖酵解/糖異生，醋酸鹽的主要代謝方式是三羧酸循環(huán)，醋酸鹽在三羧酸循環(huán)中的氧化作用提供機體代謝所需要的ATP，還能利用氫離子使機體的pH保持穩(wěn)定減少碳酸氫鹽的消耗，含量升高表明可能存在丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等代謝障礙[9]。

丙酮酸鹽是糖酵解的產(chǎn)物，是糖類代謝物和脂類代謝物進入三羧酸循環(huán)的媒介物，調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)水平，三羧酸循環(huán)是有氧代謝的主要途徑，丙酮酸鹽含量升高阻礙有氧呼吸的正常進行[9]。

本研究顯示，與高尿酸血癥病人比較，原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人的乳酸含量病人偏高，丙氨酸含量偏低，說明原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人能量代謝障礙較單純高尿酸血癥嚴重。在糖代謝方面，原發(fā)性高血壓合并高尿酸血癥病人較健康人乳酸、葡萄糖含量偏高，肌酸偏低；高尿酸血癥病人較健康人的丙氨酸、丙酮酸鹽含量升高，醋酸鹽含量降低，說明能量代謝紊亂參與高血壓合并高尿酸血癥、高尿酸血癥的發(fā)生。

綜上所述，利用1H-NMR代謝組學(xué)方法可區(qū)分高血壓合并高尿酸血癥病人、高尿酸血癥病人和健康人，高血壓合并高尿酸血癥的脂類代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂、糖代謝紊亂較單純高尿酸血癥更嚴重。通過對內(nèi)源性代謝產(chǎn)物比較和分析，可知高血壓合并高尿酸血癥這一與代謝有關(guān)疾病的發(fā)生與脂類代謝、氨基酸代謝、糖代謝、能量代謝等多種通路的異常相關(guān)，這是機體多個系統(tǒng)功能改變共同造成的結(jié)果。

本研究對高血壓合并高尿酸血癥、單純高尿酸血癥的代謝標志物進行初步探索，獲得一些潛在的標志物，今后研究還需進一步運用代謝物靶標分析、代謝物濃度的統(tǒng)計分析，并適當(dāng)擴大樣本量，進行標志物確認。代謝組學(xué)作為一種新型輔助手段，對研究疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程及尋找疾病新的生物標志物有廣闊的研究和應(yīng)用前景。

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