放射性125I粒子聯(lián)合塞來昔布對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制

方靜，向梅，向桂玲，姚遙

(1青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東青島266003；2荊州市醫(yī)療事故技術(shù)鑒定辦公室；3武漢大學(xué)人民醫(yī)院)

近年來，125I粒子連續(xù)低劑量照射因其創(chuàng)傷低、靶向效果佳、并發(fā)癥少等特點(diǎn)，越來越廣泛用于胃癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤治療[1]。環(huán)氧化酶-2(Cox-2)過表達(dá)于肺癌、胃癌、宮頸癌等惡性腫瘤，并與疾病預(yù)后密切相關(guān)，塞來昔布作為Cox-2特異性抑制劑，在腫瘤防治中備受關(guān)注。有研究表明，塞來昔布在肺癌、胃癌、宮頸癌等惡性腫瘤的治療中具有放射增敏作用[2]。本研究應(yīng)用125I粒子聯(lián)合塞來昔布治療人胃癌裸鼠移植瘤模型，觀察抑瘤效果和放射增敏作用，并初步探討相關(guān)的抑制機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料4～6周齡BALA/c-nu小鼠48只，雌性，體質(zhì)量16～18 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[合格證號(hào)SCXK(京)2014-0004]；人胃癌MKN45細(xì)胞購自美國菌種保藏中心(美國ATCC公司)；125I粒子由北京智博高科生物技術(shù)有限公司提供；4%多聚甲醛購自北京碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取液購自上海優(yōu)選生物科技有限公司；cDNA合成試劑盒購自美國Thermo公司；引物由上海生物工程有限公司合成；Ki-67兔抗鼠單克隆抗體購自英國Abcam公司；TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏公司；RM2016病理切片機(jī)購自上海徠卡儀器有限公司；Nikon DS-U3成像系統(tǒng)購自日本尼康；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司；FBZ2001-up-p標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀購自青島富勒姆科技有限公司。

1.2動(dòng)物分組及MKN45移植瘤模型構(gòu)建 取對(duì)數(shù)期MKN45細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，接種于裸鼠左背部近頭側(cè)皮下，7 d左右成瘤，待腫瘤長(zhǎng)至(300±50)mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、塞來昔布組、粒子植入組和聯(lián)合治療組，每組12只。125I粒子活度為0.6 mCi，固定裸鼠，消毒瘤體及周圍皮膚，用穿刺針將粒子置入瘤體中央。對(duì)照組和粒子植入組改飲含0.025%Tween-20和0.5%羧甲基纖維素鈉的水溶液，塞來昔布組和聯(lián)合治療組飲含塞來昔布的溶液[(溶解在 0.025%Tween-20 和0.5%羧甲基纖維素鈉的水溶液中，100 mg/(kg·d)]；粒子植入組和聯(lián)合治療組置入一枚125I粒子，連續(xù)觀察30 d，測(cè)量移植瘤的最長(zhǎng)徑和橫徑，斷頸法處死裸鼠，取一小塊粒子附近瘤組織放入4%多聚甲醛，固定24 h；余下的瘤組織于液氮保存，粒子全部取出，集中于鉛盒，做安全處理。

1.3裸鼠腫瘤體積、抑瘤率測(cè)算按公式V=L×W2/2(L:最長(zhǎng)徑，W:與L相垂直的橫徑)計(jì)算腫瘤體積；抑瘤率(IR)=(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.4各組瘤細(xì)胞增殖、凋亡情況觀察 按免疫組化SP法對(duì)Ki-67進(jìn)行免疫化學(xué)分析；TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，嚴(yán)格按照說明書操作，對(duì)所取瘤組織進(jìn)行凋亡檢測(cè)。結(jié)果判定：Ki-67陽性細(xì)胞主要位于細(xì)胞核，為棕黃色或棕褐色染色，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400×)，分別計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及腫瘤細(xì)胞總數(shù)。增殖指數(shù)(PI)%=陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%；TUENL判定方法與Ki-67相同，凋亡指數(shù)(AI) %=凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%[3]。

1.5腫瘤組織中Caspase-8、Bax mRNA表達(dá)測(cè)定采用RT-PCR法。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參為β-actin，mRNA相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。引物序列由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成。引物序列：Caspase-8正向引物：5′-TACTCGAGATGGCGGAGTCTTCGGATAA-3′，反向引物：5′-TAGGGCCCTTACCACAGGGAGGTCTTAA-3′，產(chǎn)物234 bp；Bax正向引物：5′-GCCCACCAGCTCTGAGCAGATCAT-3′，反向引物：5′-CGGCAATCATCCTCTGCAGC-3′，產(chǎn)物209 bp；β-actin正向引物：5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′，反向引物：5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′，產(chǎn)物260 bp。

2　結(jié)果

表1　　　　治療30 d時(shí)各組裸鼠瘤重、腫瘤體積

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與塞來昔布組比較，bP<0.05；與粒子植入組比較，cP<0.05。

2.2各組腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡情況比較對(duì)照組、塞來昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組PI分別為81.04%±10.12%、77.20%±6.22%、56.20%±8.35%、52.60%±6.03%；對(duì)照組、塞來昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組AI分別為62.50%±4.69%、68.80%±5.52%、82.04%±2.58%、86.83%±4.51%。組間兩兩比較，P均<0.05。

2.3各組腫瘤組織中Caspase-8、Bax mRNA表達(dá)量比較對(duì)照組、塞來昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組Caspase-8 mRNA表達(dá)量依次增多，分別為1、1.38±0.12、1.72±0.35、2.36±0.33；對(duì)照組、塞來昔布組、粒子植入組、聯(lián)合治療組Bax mRNA表達(dá)量同樣依次增多，分別為1、2.04±0.22、2.46±0.58%、3.13±0.51。組間兩兩比較，P均<0.05。

3　討論

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤，發(fā)病率高，預(yù)后較差。傳統(tǒng)放療在胃癌治療中占重要地位，然而引起周圍正常組織壞死、輻射劑量大等不良反應(yīng)使其臨床應(yīng)用受限。近年來，近距離放射治療做為惡性腫瘤的輔助治療已越來越廣泛用于臨床，125I粒子是該治療常用的放射性粒子，在腫瘤組織局部持續(xù)低劑量釋放射線，最大程度殺傷病灶，而對(duì)周圍正常組織損傷較小[4]。研究證實(shí)塞來昔布在腫瘤治療中有很好的放射增敏作用，還能發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。本研究中，我們通過構(gòu)建人胃癌裸鼠移植瘤模型，探討125I放射性粒子聯(lián)合塞來昔布是否能達(dá)到放射增敏效應(yīng)，是否通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡達(dá)到目的，以及Caspase-8、Bax基因是否參與調(diào)控等。

前列腺素可誘導(dǎo)腫瘤形成、腫瘤微血管生成、遏制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而Cox-2抑制劑是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的主要限速酶。Cox-2表達(dá)在惡性腫瘤生成的早期上調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，與惡性腫瘤預(yù)后較差密切相關(guān)。Cox-2高表達(dá)還與腫瘤對(duì)放化療藥物的耐受性有關(guān)[6]。近年來，塞來昔布作為一線Cox-2抑制劑與癌癥的關(guān)系已成為研究熱點(diǎn)。塞來昔布是一種非甾體抗炎藥(NSAIDs)，與其他NSAIDs一樣，能在體內(nèi)和體外干擾腫瘤的生成或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。左朝暉等[7]通過構(gòu)建肝癌HepG2裸鼠移植瘤，證實(shí)塞來昔布通過抑制Cox-2表達(dá)，能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)和腫瘤微血管形成。相關(guān)的體內(nèi)研究表明，塞來昔布通過下調(diào)Survivin表達(dá)，抑制人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。這些發(fā)現(xiàn)均提示塞來昔布是很有潛力的抗癌藥物。梁彩霞等[9]觀察塞來昔布對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株和宮頸癌HeLa細(xì)胞株的放射增敏作用，表明塞來昔布能有效抑制腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射損傷的修復(fù)能力，增強(qiáng)放射線的殺傷力。李麗萍等[10]通過回顧分析90例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者，證實(shí)塞來昔布可增加NSCLC患者的放療敏感性，提高臨床療效、延長(zhǎng)患者生存期。

本實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)的胃癌MKN45細(xì)胞株接種到裸鼠皮下形成移植瘤，125I放射性粒子聯(lián)合塞來昔布進(jìn)行治療，結(jié)果顯示對(duì)照組腫瘤體積和瘤重較另外三組增大，聯(lián)合治療組腫瘤體積和瘤重則比塞來昔布組和粒子植入組減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)照組腫瘤中央?yún)^(qū)出現(xiàn)潰破壞死，聯(lián)合治療組未見，可能與塞來昔布的抗腫瘤、抗炎作用相關(guān)。塞來昔布組、粒子植入組和聯(lián)合治療組抑瘤率分別為19.9%、45.3%、61.3%，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明125I放射性粒子聯(lián)合塞來昔布能明顯抑制胃癌移植瘤的生長(zhǎng)，呈放射增敏效應(yīng)。

凋亡是一系列形態(tài)學(xué)變化和生化反應(yīng)構(gòu)成的細(xì)胞程序性死亡，在免疫系統(tǒng)和自體調(diào)節(jié)系統(tǒng)等多種生物進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。非典型細(xì)胞通過凋亡的抑制而存活，顯著促進(jìn)惡性腫瘤生成，使癌細(xì)胞特異性生長(zhǎng)。凋亡同時(shí)亦是放化療細(xì)胞毒性效應(yīng)之一。Ma等[11]構(gòu)建NCI-N87胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤，采用125I粒子進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果表明125I粒子能誘導(dǎo)凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)還抑制移植瘤的生長(zhǎng)。大量研究表明，Cox-2抑制劑亦可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組的增殖指數(shù)下降、凋亡指數(shù)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。塞來昔布聯(lián)合125I放射性粒子通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡治療腫瘤，發(fā)揮放射增敏效應(yīng)。

Caspase-8可自我活化，參與細(xì)胞凋亡的起始，啟動(dòng)凋亡的細(xì)胞內(nèi)途徑。Bax是Bcl-2家族最有代表性的促凋亡基因之一，可在體內(nèi)拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用。激活的Caspase-8能在胞質(zhì)中裂解Bcl-2家族成員Bid，與Bax發(fā)揮促凋亡作用[13]。鐘漓等[14]研究表明，塞來昔布能抑制Bcl-2基因表達(dá)、促進(jìn)Bax基因表達(dá)，從而開啟線粒體凋亡通路。Liu等[15]研究顯示，塞來昔布可下調(diào)鼻咽癌HONE-1細(xì)胞的Bcl-2基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增加鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合治療組的腫瘤組織Caspase-8、Bax mRNA表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示125I放射性粒子聯(lián)合塞來昔布通過上調(diào)促凋亡相關(guān)基因Caspase-8、Bax表達(dá)，抑制腫瘤生長(zhǎng)，提高放療敏感性。

百年大計(jì)，質(zhì)量第一。水利電力工程關(guān)系著人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全。抓好工程建設(shè)質(zhì)量管理是每一個(gè)工程參建單位義不容辭的責(zé)任。工程建設(shè)項(xiàng)目法人在抓質(zhì)量上應(yīng)首先抓好工程項(xiàng)目承建單位的擇優(yōu)選取工作：一是對(duì)參標(biāo)單位進(jìn)行認(rèn)真的調(diào)研，參標(biāo)企業(yè)實(shí)力要與擬招工程項(xiàng)目相適應(yīng)；二是選擇中標(biāo)單位時(shí)以選擇擬定進(jìn)場(chǎng)的項(xiàng)目經(jīng)理為主要條件；三是商討合同協(xié)議書時(shí)，必須注明選定的項(xiàng)目經(jīng)理在承建工程施工完成前不得更換。

總之，塞來昔布通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡增強(qiáng)患者的125I粒子輻射敏感性，達(dá)成更強(qiáng)的抑瘤效果；其促凋亡機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡基因Caspase-8、Bax表達(dá)有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Tan Q, Qin Q, Yang W, et al. Combination of125I brachytherapy and chemotherapy for unresectable recurrent breast cancer: A retrospective control study [J]. Medicine, 2016,95(44):e5302.

[2] Nurul Akmar M, Laimeng L, Nik Raihan NM, et al. Cyclooxygenase-2 expression in invasive breast carcinomas of no special type and correlation with pathological profiles suggest a role in tumorigenesis rather than cancer progression[J]. Apjcp, 2015,16(4):1553-1558.

[3] Arima N, Nishimura R, Osako T, et al. The importance of tissue handling of surgically removed breast cancer for an accurate assessment of the Ki-67 index[J]. J Clin Pathol, 2016,69(3):255-259.

[4] WPark DS, Gong IH, Choi DK, et al. Radical prostatectomy versus high dose permanent prostate brachytherapy using iodine-125 seeds for patients with high risk prostate cancer: a matched cohort analysis[J]. World J Urol, 2013,31(6):1511-1517.

[5] 丁翔,嚴(yán)春寅.環(huán)氧化酶-2在在前列腺腫瘤中的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)：泌尿系統(tǒng)分冊(cè),2004,24(2):169-172.

[6] Salvado MD, Alfranca A, Haeggstr?m JZ, et al. Prostanoids in tumor angiogenesis: therapeutic intervention beyond Cox-2[J]. Trends Mol Med, 2012,18(4):233-243.

[7] 左朝暉,黎祖榮,周曉,等.環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來昔布對(duì)人肝癌HepG2裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成的抑制作用[J].癌癥,2006,25(4):414-420.

[8] 向銀洲,余林,魏蓮枝,等.塞來昔布對(duì)鼻咽癌放射治療增敏作用的臨床研究[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科,2012,19(1):16.

[9] 梁彩霞,江丹賢.龐雅君.塞來昔布對(duì)女性常見惡性腫瘤細(xì)胞株的放療增敏作用[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2012,18(3):72-75.

[10] 李麗萍,余志高,李小菊，等.塞來昔布對(duì)非小細(xì)胞肺癌放療的增敏作用[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2017,29(1):40-42.

[11] Ma ZH, Yang Y, Zou L, et al.125I seed irradiation induces up-regulation of the genes associated with apoptosis and cell cycle arrest and inhibits growth of gastric cancer xenografts[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2012,31:61.

[12] Atari-hajipirloo S, Nikanar S, Heydari A, et al. The effect of celecoxib and its combination with imatinib on human HT-29 colorectal cancer cells: Involvement of Cox-2,Caspase-3,VEGF and NF-κB genes expression [J]. Cell Mol Biol( Noisy-le-grand), 2016,62(2):68-74.

[13] Odonkor CA, Achilefu S. Modulation of effect or caspase cleavage determines response of breast and lung tumor cell lines to chemotherapy[J]. Cancer Invest, 2009,27(4):417-429.

[14] 鐘漓,張廣鈺,董陳誠，等. 塞來昔布對(duì)胃癌細(xì)胞SGC7901凋亡的影響及其作用機(jī)制[J].廣西醫(yī)學(xué),2015,37(8):1069-1071.

[15] Liu DB, Long GX, Mei Q, et al. Anticancer effects of celecoxib through inhibiton of STAT3 phosphorylation and AKT phosphorylation in nasopharyngeal carcinoma cell lines[J]. Pharmazie, 2014,69(5):358-361.