ILK、Cyclin D1及MMP-9在膀胱癌中的表達及意義

高　娟,張渭波,李　卓,董兵衛(wèi)*

(1西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科,西安　710077;2咸陽市中心醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:rxrfdbw@126.com)

根據(jù)美國癌癥學(xué)會統(tǒng)計,膀胱癌是全球病死率較高的惡性腫瘤之一。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程,與細(xì)胞周期失控和腫瘤細(xì)胞間黏附力下降有密切的關(guān)系[1],因此,探明膀胱癌生長、增殖的關(guān)鍵靶基因和分子,為其安全有效地診斷、治療,提高患者的生存率和生活質(zhì)量具有重要的意義。

整合素連接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)是一個59 kDa的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白,它在胞內(nèi)的兩個靶向催化位點是蛋白激酶B和糖原合成酶激酶-3。研究顯示,ILK與結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的發(fā)生、分化及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2],而我們前期實驗證實,運用siRNA ILK或小分子抑制劑抑制ILK的活性,在膀胱癌細(xì)胞中,可以抑制細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和血管生成[3]。Cyclin D1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一,其過度表達是人類多種原發(fā)性腫瘤的特征[4],許多腫瘤存在它們的表達異常?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的重要成員之一,其作用于癌細(xì)胞介導(dǎo)的ECM降解活動中,可破壞基底膜,從而促發(fā)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與浸潤[5]。有資料表明,整合素連接激酶可刺激MMP-9的表達,并在惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮作用[6]。目前有關(guān)ILK、CyclinD1和MMP-9在膀胱癌中的表達及其相互作用的研究,國內(nèi)外報道很少。因此,本實驗運用免疫組化方法檢測ILK、CyclinD1和MMP-9在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達情況,以探討其與膀胱癌病理分級的關(guān)系及三者的相關(guān)性,為進一步研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展機制、診治和評價預(yù)后提供必要的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　一般資料

收集2014-01～2016-12咸陽市中心醫(yī)院病理科膀胱腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本,取58例(其中男45例,女13例)膀胱癌,經(jīng)病理證實為原發(fā)性膀胱癌,且無進行放、化療?；颊吣挲g52-76歲,平均年齡64歲。同時取相應(yīng)癌旁正常膀胱組織20例,用10%中性福爾馬林固定標(biāo)本,經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋,用4 μm厚連續(xù)切片。

1.2　方法

1.2.1主要試劑兔抗人ILK多克隆抗體、免疫組化及DAB染色試劑盒購自博奧森公司;兔抗人CyclinD1及MMP-9多克隆抗體為福州邁新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2.2免疫組化免疫組化采用SP法進行染色,一抗兔抗人ILK、CyclinD1及MMP-9多克隆抗體稀釋濃度為1 ∶100。操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明進行,以0.01 mol/L PBS(pH 7.4)替代一抗作為陰性對照,用已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.3結(jié)果判斷ILK和MMP-9陽性染色細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)中見淺或棕黃(褐)色顆粒,CyclinD1陽性染色細(xì)胞定位于細(xì)胞核內(nèi),由3位病理醫(yī)師分別獨立觀察3個檢測指標(biāo),最后結(jié)果取3人的平均值。①隨機選擇10個高倍視野,計數(shù)1 000個細(xì)胞,計數(shù)陽性細(xì)胞百分率:陽性細(xì)胞數(shù)<10%為0分,10%-50%為1分,50%-90%為2分,>90%為3分。②癌細(xì)胞染色強度:無著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃(褐)色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘:0-1分為陰性(-),2-4分為弱陽性(+),6-8分為陽性(++),9分為強陽性(+++)。

1.3　統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,各組間樣本差異及兩組資料間的相關(guān)性分別采用χ2檢驗及Spearman等級相關(guān)分析法處理統(tǒng)計結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1　ILK、CyclinD1及MMP-9在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達

ILK、CyclinD1及MMP-9在膀胱癌組織中的陽性表達見圖1。ILK在58例膀胱癌及20例癌旁正常組織中的陽性表達率分別為62.1%(36/58)和15.0%(3/20),且隨著腫瘤分化程度的降低表達呈遞增趨勢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.139,P<0.05)。CyclinD1的陽性表達分別為70.7%(41/58)和20.0%(4/20),其在正常膀胱組織中的表達信號最弱,并隨著腫瘤分化程度的增加其表達率呈下降趨勢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.655,P<0.05)。MMP-9的陽性表達分別為65.5%(38/58)和15.0%(3/20),且在高分化癌中的表達呈中度陽性,在低分化癌中的表達呈強陽性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.221,P<0.05,見表1)。

表1ILK、CyclinD1及MMP-9在膀胱癌和癌旁正常組織中的表達

Table1ExpressionofILK,CyclinD1andMMP-9inbladdercancerandnormalcontrol

組別　n　ILKCyclinD1MMP?9陽性χ2P陽性χ2P陽性χ2P　膀胱癌組58　36(621)16139<00541(707)15655<00538(655)15211<005　正常組　20　3(15．0)4(20．0)3(15．0)

2.2　ILK、CyclinD1及MMP-9表達與膀胱癌病理分級的關(guān)系

ILK在膀胱癌不同病理分級間的表達為:低分化75.7%(25/33),高分化44.0%(11/25),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.093,P<0.05);CyclinD1在膀胱癌不同病理分級間的表達為;低分化84.8%(29/33),高分化48.0%(12/25),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.408,P<0.05);MMP-9在膀胱癌不同病理分級間的表達:低分化78.8%(26/33),高分化48.0%(12/25),兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.968,P<0.05,見表2)。

2.3　膀胱癌中CyclinD1、MMP-9與ILK表達的相互關(guān)系

膀胱癌中CyclinD1與ILK表達呈正相關(guān)(r=0.3,P<0.05),MMP-9與ILK表達亦呈正相關(guān)(r=0.3,P<0.05,見表3)。

A.膀胱癌組織：細(xì)胞核高度異型，間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)單個癌細(xì)胞或不規(guī)則形的癌巢(HE染色,×100);B.ILK在膀胱癌組織中陽性表達，(SP法,×100);C.Cyclin D1在膀胱癌組織中陽性表達(SP法,×100);D.MMP-9在膀胱癌組織中陽性表達(SP法,×100)圖1　ILK、CyclinD1及MMP-9在膀胱癌組織中的表達Figure 1　Expression of ILK, CyclinD1 and MMP-9 in bladder cancer

表2ILK、CyclinD1及MMP-9表達與膀胱癌病理分級的關(guān)系

Table2RelationshipbetweentheexpressionofILK,CyclinD1andMMP-9andthepathologicalgradeofbladdercancer

病理分級n　ILKCyclinD1MMP?9陽性χ2P陽性χ2P陽性χ2P　低分化33　25(757)6039<00529(848)7408<00526(788)5968<005　高分化25　11(44．0)12(48．0)12(48．0)

表3CyclinD1、MMP-9與ILK在膀胱癌中表達的關(guān)系

Table3RelationshipbetweentheexpressionofCyclinD1,MMP-9andILKinbladdercancer

ILKCyclinD1MMP?9+-rP+-rP+29703<00528803<005-12101012

3　討論

研究結(jié)果表明,ILK、CyclinD1、MMP-9在膀胱癌中的表達明顯高于癌旁正常組織。提示三種蛋白在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中均上調(diào),即涉及三種蛋白的激活。在對其表達和膀胱癌分化程度之間的關(guān)系研究發(fā)現(xiàn),三種蛋白在膀胱癌中的表達隨著腫瘤分化程度的增加而增強,與國內(nèi)外關(guān)于ILK、CyclinD1、MMP-9的獨立研究一致[7,8]。研究還發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織中ILK與CyclinD1及ILK與MMP-9的表達均呈正相關(guān),表明ILK的高表達促使CyclinD1、MMP-9的表達上調(diào),增強了腫瘤細(xì)胞的侵襲能力,其確切機制尚待研究。現(xiàn)代學(xué)者在觀察腫瘤的不協(xié)調(diào)生長和增生時,發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)的蛋白,并認(rèn)為腫瘤與細(xì)胞周期調(diào)控失常有著密切聯(lián)系[9]。cyclin D1作為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子之一,其過度表達是多種人類原發(fā)性腫瘤的特征,對腫瘤的診斷和預(yù)后判斷具有重要意義[10]。本實驗發(fā)現(xiàn),CyclinD1在膀胱癌中的表達明顯高于癌旁正常組織,且CyclinD1的表達隨腫瘤惡性程度的增加而增高,其過度表達與腫瘤的分化程度密切相關(guān)。因此,可以推斷,CyclinD1作為原癌基因,促增殖作用的細(xì)胞周期素,在分化較差增殖較多的低分化腫瘤中表達更多,提示CyclinD1表達異?？赡苁前螂装┌l(fā)生的分子事件。以上結(jié)果與以往研究報道結(jié)果大致相同[8]。本研究表明,CyclinD1在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用,并且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

MMPs是一組高度同源的參與基底膜與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶類,有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常組織中,MMPs沒有表達,或僅有較弱水平的表達,與良性腫瘤及正常組織相比,MMPs在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達明顯提高[11,12]。臨床上認(rèn)為,MMP-2(明膠酶A)與MMP-9(明膠酶B)是與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的MMPs家族[13]。大量研究表明,MMP-9在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)過度表達,在惡性腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要角色[14]。本研究發(fā)現(xiàn),MMP-9在膀胱癌組織中的表達顯著高于正常組織,且腫瘤分化程度越低,MMP-9的表達越高;提示MMP-9與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為反映膀胱癌惡性程度的指標(biāo)之一,用于預(yù)測膀胱癌患者的預(yù)后。目前有研究證實,ILK可以使MMP-9表達上調(diào),參與生長因子信號通路[15],我們研究也發(fā)現(xiàn),ILK與MMP-9在膀胱癌組織中的表達呈顯著正相關(guān)。提示ILK和MMP-9在促進膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中可能存在某種時間或空間上的協(xié)同作用,可能的機制為高表達的ILK誘導(dǎo)MMP-9表達增加以促進細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解,從而增強腫瘤細(xì)胞的侵襲力[16],并預(yù)示聯(lián)合檢測兩項指標(biāo)有助于膀胱癌生物學(xué)行為的判斷和預(yù)后的估計。

本研究發(fā)現(xiàn),ILK、CyclinD1及MMP-9的表達與膀胱癌的臨床病理分級密切相關(guān),并且,CyclinD1、MMP-9的表達與ILK的表達均呈正相關(guān)。因此我們推測,三者可能在基因水平存在正向調(diào)節(jié)作用,ILK的高表達使得CyclinD1、MMP-9的表達上調(diào),從而在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同效應(yīng),構(gòu)成膀胱尿路上皮腫瘤惡性生物學(xué)行為的基礎(chǔ)。所以,三者聯(lián)合檢測更有助于判斷膀胱癌分級分期及預(yù)后。

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