膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠體內(nèi)Tfh細(xì)胞及其相關(guān)免疫分子的表達

王　寧,胡志芳,李愛連,郭　娜,姜鳳良

(西安醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,西安　710021;*通訊作者,E-mail:1026751112@qq,com)

interleukin-21

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以多個小關(guān)節(jié)病變?yōu)樘攸c的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,其病變特點為關(guān)節(jié)滑膜炎癥伴隨有骨質(zhì)和關(guān)節(jié)軟骨的破壞,并常有關(guān)節(jié)外器官受累,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至功能喪失[1]。目前尚無有效根治藥物和措施。該病發(fā)病機制尚未完全闡明,可能為遺傳、環(huán)境、免疫等多因素綜合作用的結(jié)果。雞Ⅱ型膠原蛋白誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠因具有和人類RA相似的病理損傷和疾病進程,成為人類RA研究的經(jīng)典動物模型[2]。

濾泡輔助性T(T follicular helper,Tfh)細(xì)胞是一類重要的CD4+T細(xì)胞亞群,可促進淋巴濾泡生發(fā)中心的形成、B淋巴細(xì)胞的發(fā)育和高親和力抗體的產(chǎn)生[3],Tfh細(xì)胞持續(xù)性高表達趨化因子受體5(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)和協(xié)同刺激性因子(inducible co-stimulator,ICOS)[4],并特異性分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素21(interleukin-21,IL-21)[5]。Bcl-6為Tfh細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,研究表明缺乏Bcl-6可引起Tfh細(xì)胞和生發(fā)中心發(fā)育受損[6]。近年來研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞免疫功能失調(diào)是RA發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[7],但相關(guān)研究多涉及到輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)如Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg),對于Tfh細(xì)胞及其相關(guān)免疫分子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人或動物模型體內(nèi)的變化鮮有報道。本文利用CIA小鼠模型,采用多種實驗方法檢測RA病理狀態(tài)下Tfh細(xì)胞及其相關(guān)免疫分子表達變化,為進一步明確Tfh細(xì)胞與RA發(fā)病機制關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　實驗試劑及儀器

雞Ⅱ型膠原、完全弗氏佐劑(Sigma,美國),RPMI 1640(Hyclone,美國),胎牛血清(四季青,浙江),小鼠淋巴細(xì)胞分離液(Dakewei,深圳),青鏈霉素混合液(博艾爾,北京),小鼠percp-CD4熒光抗體、小鼠PE-CXCR5熒光抗體、小鼠APC-ICOS熒光抗體和IgG同型抗體(Biolegend,美國),小鼠IL-21 ELISA檢測試劑盒(eBioscience,美國),RNA提取試劑盒和SuperScriptⅡ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara,日本)。

1.2　實驗動物

C57BL/6野生型雄性小鼠20只,6-8周齡,平均體質(zhì)量為(20.0±0.5)g,購自第四軍醫(yī)大學(xué),動物自由飲食,每籠5只,室溫(24±1)℃,濕度(55±5)%。

1.3　方法

1.3.1建立CIA小鼠模型將雞Ⅱ型膠原(ColⅡ)溶解于0.01 mol/L冰醋酸中,使其終濃度為2 g/L并充分混勻,4 ℃放置過夜,將濃度為5 mg/ml的完全弗氏佐劑(CFA)與預(yù)先溶解好的ColⅡ等體積混合,利用三通管預(yù)混勻后,勻漿器研磨至充分乳化呈油包水狀態(tài)。麻醉小鼠后,在其尾跟部皮下注射100 μl。首次免疫后第21天按照如上方法和相同劑量進行二次加強免疫。對照組WT小鼠按照上述方法和時間注入等量生理鹽水。ColⅡ免疫組小鼠足關(guān)節(jié)紅腫變形,提示造模成功。

1.3.2CIA小鼠關(guān)節(jié)炎癥狀評分造模后每天觀察小鼠足爪關(guān)節(jié)腫脹情況,并用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)衡量小鼠足爪部腫脹情況,肢體關(guān)節(jié)的病變程度參考以下評分進行評估[8]。0級,關(guān)節(jié)正常,無紅腫;1級,關(guān)節(jié)紅但無腫大;2級,關(guān)節(jié)輕度紅腫;3級,關(guān)節(jié)中度紅腫;4級,關(guān)節(jié)重度紅腫伴隨功能障礙。每只小鼠病情評分為其四肢關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和。關(guān)節(jié)炎評分為每只小鼠四肢關(guān)節(jié)分?jǐn)?shù)的總和,最高分為16分,AI值≥4分提示造模成功。

1.3.3實驗動物分組和取材取20只小鼠分為CIA模型組和WT正常對照組,每組各10只,小鼠造模后每日進行AI評分和病情觀察,CIA造模成功率為100%。取病情高峰期時間段(再次免疫后第26-30天)小鼠,2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠,摘除眼球進行采血并在無菌條件下分離脾臟和外周淋巴結(jié)。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測病情高峰期小鼠脾臟和淋巴結(jié)Tfh細(xì)胞表達情況制備脾臟和淋巴結(jié)單細(xì)胞懸液,利用臺盼藍拒染法確定活細(xì)胞>95%。Tfh細(xì)胞數(shù)量和比例測定:收集各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/管,1 200 r/min離心5 min,棄上清,加入流式洗液重懸,1 200 r/min離心5 min,重復(fù)該步驟兩遍,以徹底去除培養(yǎng)基;棄上清,加入細(xì)胞膜抗體,分別為:Percp標(biāo)記的CD4抗體1.25 μl,PE標(biāo)記的CXCR5抗體2.5 μl,APC標(biāo)記的ICOS抗體2.5 μl,并設(shè)置同型對照管和補償管;混勻,4 ℃放置30 min后用流式洗液洗兩遍,加入200 μl甲醛固定液保存待上機,所測結(jié)果使用FlowJo 10軟件進行分析。

1.3.5qRT-PCR檢測脾臟Bcl-6 mRNA和IL-21 mRNA表達水平使用Primer 3軟件設(shè)計引物,引物序列見表1,委托上海生工有限公司合成。將分選的脾臟細(xì)胞(2×106)置入1.5 ml EP管中,1 500 r/min離心5 min,棄上清,按照RNA提取試劑盒操作說明提取脾臟細(xì)胞RNA,DEPC水重懸后定量;利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA反轉(zhuǎn)錄后行PCR,PCR反應(yīng)體系20 μl ∶1 μl cDNA,10 μl SYBR GreenⅠ,2 μl引物,7 μl去離子水;管家基因GAPDH的表達量作為內(nèi)參照進行分析。PCR反應(yīng)條件:激活95 ℃,10 min;40個循環(huán),變性95 ℃,30 s;退火55 ℃,30 s,延伸72 ℃,1 min;擴增完成后,進行溶解曲線分析,并應(yīng)用MJ Research option2熒光定量PCR儀軟件分析目的基因的表達。

表1小鼠PCR引物序列

Table1PCRprimersequence

　基因　　　　　　引物序列　Bcl?6F：5′-GCACTGGGCAAACACAACAT-3′R：5′-AGCG-TGCCGGGTAAACTG-3′　IL?21F：5′-GGCTGCCTTACTCCTGCTG-3′R：5′-TCATCTTGCCAGGTGAGACTG-3′　GAPDHF：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3′R：5′-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3′

1.3.6ELISA檢測血漿中IL-21表達水平采集眼球血于肝素抗凝管中,混勻,2 500 r/min離心20 min,小心吸取上層血漿,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒使用說明操作,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并設(shè)空白對照,每份樣本設(shè)置復(fù)孔,酶標(biāo)儀讀取OD值后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小鼠血漿IL-21表達水平。

1.4　統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　CIA小鼠造模后AI評分

CIA組小鼠從加強免疫后出現(xiàn)活動減少、食欲和體質(zhì)量下降,尾根部皮膚逐漸紅腫潰瘍,加強免疫第10天時,絕大多數(shù)CIA模型組小鼠出現(xiàn)足爪發(fā)紅腫脹和運動受限,加強免疫第28天時,CIA小鼠病情進入高峰期,95%小鼠足爪腫脹明顯,不能負(fù)重且運動受限,31 d后足爪紅腫和運動受限逐漸減輕(見圖1),但部分小鼠遺留足爪關(guān)節(jié)畸形問題。WT對照組小鼠無異常。兩組小鼠均無死亡發(fā)生。

2.2　CIA小鼠發(fā)病高峰期脾臟Tfh細(xì)胞數(shù)量和比例變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測正常對照WT小鼠和CIA小鼠再次免疫后第26-30天脾臟CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞數(shù)量和比例。正常對照WT小鼠與CIA發(fā)病高峰期小鼠Tfh細(xì)胞在CD4+T中所占比例分別為(1.928±0.162 4)%和(2.684±0.116 8)%，見圖2，非配對t檢驗分析兩組間Tfh細(xì)胞的比例，顯示CIA小鼠脾臟Tfh細(xì)胞比例明顯高于WT小鼠，有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，此外在CIA小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中，CXCR5+細(xì)胞所占比例為(53.12±4.342)%，ICOS+細(xì)胞所占比例為(13.328±3.456)%，WT小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞中CXCR5+細(xì)胞所占比例為(42.31±3.452)%，ICOS+細(xì)胞所占比例為(11.153±2.434)%，CIA小鼠均明顯高于WT小鼠(P<0.05)。

圖1　CIA小鼠造模后平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分Figure 1　The mean arthritis index of CIA mice after modeling

2.3　CIA小鼠發(fā)病高峰期淋巴結(jié)Tfh細(xì)胞數(shù)量和比例變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測正常對照WT小鼠和CIA小鼠再次免疫第26-30天淋巴結(jié)中CD4+CXCR5+ICOS+Tfh細(xì)胞數(shù)量和比例。正常對照WT小鼠與CIA發(fā)病高峰期小鼠Tfh細(xì)胞在CD4+T中所占比例分別為(1.211±0.093 9)%和(1.960±0.169 5)%,非配對t檢驗分析兩組間Tfh細(xì)胞的比例,顯示CIA小鼠淋巴結(jié)Tfh細(xì)胞比例明顯高于WT小鼠,有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,見圖3)。此外,在CIA小鼠淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞中,CXCR5+細(xì)胞所占比例為(61.50±4.321)%，ICOS+細(xì)胞所占比例為(11.643±2.534)%，WT小鼠淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞中CXCR5+細(xì)胞所占比例為(39.24±3.547)%，ICOS+細(xì)胞所占比例為(7.820±3.214)%，CIA小鼠均明顯高于WT小鼠(P<0.05)。

2.4　CIA小鼠發(fā)病高峰期脾臟Bcl-6 mRNA和IL-21 mRNA表達水平

實時熒光定量PCR檢測正常對照WT小鼠和CIA發(fā)病高峰期小鼠脾臟Bcl-6 mRNA和IL-21mRNA表達水平,非配對t檢驗分析結(jié)果顯示:CIA發(fā)病高峰期小鼠脾臟Bcl-6 mRNA表達倍數(shù)比率(1.000±0.050 69)明顯高于正常對照WT小鼠(0.600±0.050 54),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4);CIA發(fā)病高峰期小鼠脾臟IL-21mRNA表達倍數(shù)比率(1.000±0.060 75)明顯高于正常對照WT小鼠(0.530±0.050 54),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

圖2　CIA小鼠發(fā)病高峰期脾臟CD4+T細(xì)胞中Tfh細(xì)胞比例變化Figure 2　Changes of Tfh cell percentage in splenic CD4+T cells during the incidence peak of CIA mice

圖3　CIA小鼠發(fā)病高峰期淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞中Tfh細(xì)胞比例變化Figure 3　Changes of Tfh cell percentage in CD4+T cells of lymph nodes during incidence peak of CIA mice

圖4　CIA小鼠發(fā)病高峰期脾臟細(xì)胞中Bcl-6 mRNA表達水平Figure 4　Expression of Bcl-6 mRNA in spleen cells of CIA mice during the incidence peak

圖5　CIA小鼠發(fā)病高峰期脾臟細(xì)胞中IL-21 mRNA表達水平Figure 5　Expression of IL-21 mRNA in spleen cells of CIA mice during the incidence peak

2.5　CIA小鼠發(fā)病高峰期血漿中IL-21表達水平

ELISA檢測正常對照WT小鼠和CIA發(fā)病高峰期小鼠血漿IL-21表達水平,結(jié)果顯示CIA小鼠血漿IL-21表達量為(104.3±3.541)pg/ml,明顯高于正常對照WT小鼠IL-21表達水平[(60.2±10.170)pg/ml],非配對t檢驗分析顯示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖6)。

圖6　CIA小鼠發(fā)病高峰期血漿中IL-21表達水平Figure 6　Expression of IL-21 in plasma of CIA mice during the incidence peak

3　討論

近年來,越來越多的研究證實RA的發(fā)生與免疫系統(tǒng)異常激活密切相關(guān),如持續(xù)存在的Th1和Th17反應(yīng)以及它們所分泌的細(xì)胞因子參與到以RA為代表的多種自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中[9]。Tfh是近年來發(fā)現(xiàn)的一種特殊Th細(xì)胞,特異性高表達CXCR5和ICOS并分泌細(xì)胞因子IL-21,通過多種方式實現(xiàn)對B細(xì)胞進行調(diào)節(jié)作用并輔助B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞和長期駐留的記憶性B細(xì)胞,從而間接調(diào)控體液免疫來影響免疫應(yīng)答[10],研究表明Tfh細(xì)胞參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、甲狀腺功能亢進和干燥綜合征等多種自身免疫性疾病病理進程[11,12]。

在本實驗中我們檢測CIA發(fā)病高峰期小鼠脾臟和淋巴結(jié)Tfh細(xì)胞數(shù)量比例,結(jié)果顯示CIA小鼠脾臟和淋巴結(jié)CD4+T中Tfh細(xì)胞比例明顯增高,脾臟和淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞中CXCR5和ICOS的表達均增高,因趨化因子CXCR5為歸巢分子,可促使B淋巴細(xì)胞歸巢到淋巴結(jié)濾泡并促進淋巴濾泡集結(jié)和發(fā)育,而表達于Tfh細(xì)胞上的ICOS與B細(xì)胞上高表達的ICOSL結(jié)合可誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞表達Bcl-6,從而促進Tfh細(xì)胞分化、增殖,使其產(chǎn)生更多的IL-21、IL-4、IL-10等以進一步增強B細(xì)胞功能,故此結(jié)果說明了在RA發(fā)病高峰期,體內(nèi)異常增高的Tfh細(xì)胞及其相關(guān)特異性免疫分子均參與了炎癥免疫應(yīng)答過程和病理進程,此結(jié)果與Simpson等[13]在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人中的研究結(jié)果一致。另外,我們檢測到CIA發(fā)病高峰期小鼠脾臟Bcl-6 mRNA和IL-21 mRNA表達均升高且血漿中IL-21含量升高。早在2009年就發(fā)現(xiàn)Bcl-6過表達可誘導(dǎo)Tfh細(xì)胞相關(guān)基因表達,并以DNA結(jié)合依賴性方式抑制其他Th譜系細(xì)胞分化[14],同時文獻報道IL-21可以促進Tfh細(xì)胞Bcl-6的上調(diào)[15],且Tfh細(xì)胞可高水平分泌細(xì)胞因子IL-21[16],并通過自分泌的方式刺激T-B細(xì)胞交互作用,促進抗體產(chǎn)生和B細(xì)胞對胸腺依賴性抗原應(yīng)答后漿細(xì)胞產(chǎn)生的IgG1類別轉(zhuǎn)化[10],活化的Tfh細(xì)胞可通過釋放IL-21等細(xì)胞因子促進CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增殖,使CD4+T/CD8+T比例失調(diào),進一步加重炎癥反應(yīng)[17,18]。綜合以上結(jié)果,更加明確了Tfh參與RA炎癥的發(fā)展從而促進了自身反應(yīng)性抗體的出現(xiàn),在RA病理性免疫應(yīng)答進程中發(fā)揮著重要作用。

綜上所述,本實驗利用人類RA經(jīng)典動物模型CIA小鼠,系統(tǒng)檢測了CIA小鼠發(fā)病高峰期外周免疫器官Tfh細(xì)胞和相關(guān)免疫分子(ICOS,CXCR5,Bcl-6)表達情況并檢測了血漿中與Tfh細(xì)胞分泌水平,明確Tfh細(xì)胞可通過細(xì)胞因子IL-21、跨膜分子ICOS和CXCR5以及轉(zhuǎn)錄因子Bcl-6參與RA病理進程,但相關(guān)調(diào)控機制仍需通過進一步實驗來明確,此研究可為深入研究RA發(fā)病機制提供實驗基礎(chǔ),為其有效治療提供新的思路。

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