HIF-1α在喉鱗癌組織芯片中的表達(dá)及臨床意義

馮　彥,孟亞萍,雒紅霞,白　瑋,張　森,王斌全1,

(1山西醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院五官科護(hù)理教研室,太原　030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉頭頸外科;3山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;4山西省腫瘤醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:wbq-xy@sxent.org)

喉癌是最常見的呼吸道惡性腫瘤之一。男性發(fā)病率遠(yuǎn)高于女性,以喉鱗狀細(xì)胞癌最為常見。據(jù)報(bào)道,確診喉癌時(shí)60%的患者已為晚期[1]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),1975-1977年喉癌患者5年相對(duì)存活率為66%,而2005-2011年喉癌患者5年相對(duì)存活率為63%[2],盡管對(duì)喉癌的治療方法不斷改進(jìn)，但是喉癌患者的5年相對(duì)存活率并未明顯提高。喉癌的治療在過去的幾十年中雖然有很大的進(jìn)展,但由于喉功能的特殊性,在治療時(shí)除生存率外,需要尤為考慮喉的發(fā)音、呼吸及吞咽功能。因此,很有必要繼續(xù)對(duì)喉癌進(jìn)行深入研究。

缺氧現(xiàn)象是實(shí)體瘤的重要特征,缺氧不僅可觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列應(yīng)急性保護(hù)反應(yīng),還與腫瘤細(xì)胞的一些生物學(xué)行為密切相關(guān),例如:侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成及細(xì)胞凋亡。缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是1992年Semenza和Wang首先發(fā)現(xiàn)的一種存在于人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。HIF-1是由一個(gè)α亞基(HIF-1α)和一個(gè)β亞基(HIF-1β)組成的異源二聚體蛋白。HIF-1α是介導(dǎo)細(xì)胞對(duì)缺氧微環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

本研究中,我們將采用免疫組化的方法檢測(cè)喉鱗癌組織中HIF-1α的表達(dá),探討HIF-1α與喉鱗癌的臨床病理學(xué)特征及預(yù)后、轉(zhuǎn)移的關(guān)系,及其在喉癌病程中的重要作用,為喉癌的診斷治療提供一定的參考。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

共收集138例山西省腫瘤醫(yī)院2006-03～2008-12手術(shù)切除和病理確診的喉鱗狀細(xì)胞癌患者,平均年齡58.50歲。其中,男性132例,女性6例。納入患者術(shù)前均未行放化療,且均為首次手術(shù)。經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意后進(jìn)行標(biāo)本取材,知情同意書由患者本人或家屬簽署。

1.2　方法

1.2.1制作組織芯片收集138例喉鱗癌組織蠟塊,首先進(jìn)行蘇木精-伊紅染色切片,并進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,同時(shí)在蠟塊上找到對(duì)應(yīng)點(diǎn)作出標(biāo)記。使用組織芯片陣列儀,從定位的目標(biāo)石蠟塊上鉆取組織,將所取組織轉(zhuǎn)移到空白石蠟的相應(yīng)位置,54 ℃恒溫箱加熱,使組織芯片和受體蠟塊相互融合,4 μm切片,制作成5塊5×6組織芯片。138例喉鱗癌患者中選取喉鱗癌癌旁正常組織32例。

1.2.2HIF-1α免疫組織化學(xué)染色HIF-1α鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,PV-9000通用型二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;DAB試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3結(jié)果判定HIF-1α在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中表達(dá),胞漿中可見棕黃色的較大顆粒,細(xì)胞核周圍表達(dá)明顯,少量位于細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)細(xì)胞漿和核中棕色顆粒的細(xì)胞進(jìn)行分析。

細(xì)胞漿核出現(xiàn)均勻一致的棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。每張切片隨機(jī)取3個(gè)高倍視野,以陽(yáng)性細(xì)胞比例的平均值定義為該腫瘤的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。按標(biāo)準(zhǔn)判斷:陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為“-”;10%-25%為“+”;26%-75%為“++”;>75%為“+++”。以(+)-(+++)為陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料以例(%)表示,采用Fisher確切概率法或卡方檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　喉鱗癌病例的臨床病理資料及芯片有效性

將138例喉鱗癌患者的組織蠟塊均制成每例5塊5×6組織芯片蠟塊。其中,9例組織因未取到鱗癌組織或者所取鱗癌組織很少而無法進(jìn)行有效分析,由于實(shí)驗(yàn)中7例組織掉片,最終芯片中可以進(jìn)行有效分析的組織共122例(見表1)。其中,男性116例,女性6例,年齡38-79歲,平均年齡59歲。聲門上型患者78例(63.9%),聲門型21例(17.2%),聲門下型3例(24.6%),由于資料不全,20例患者(16.4%)臨床分型不確定。T1期患者10例(8.2%),T2期患者33例(27%),T3期患者66例(54.1%),T4期患者13例(10.7%)。33例患者(27.0%)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,80例患者(65.6%)確診時(shí)均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,9例患者(7.4%)資料不全無法確定是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

2.2　免疫組化法檢測(cè)HIF-1α蛋白

HIF-1α蛋白在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá),主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞核中表達(dá),呈黃色或棕黃色(見圖1)。

A.陽(yáng)性表達(dá)(×40)　 　　　B.高表達(dá)(×100)圖1　HIF-1α在喉鱗癌組織中的表達(dá)Figure 1　Expression of HIF-1α in laryngeal squamous cell carcinoma

本研究122例喉鱗癌患者中HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為62.3%(76/122)。32例喉癌癌旁正常組織中HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為9.4%(3/32)。喉鱗癌組織中HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織,且兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示:HIF-1α蛋白表達(dá)與喉鱗癌組織TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05),即在TNM分期較晚以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中,HIF-1α蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)。而與喉癌患者的年齡、性別及病變位置均無關(guān)(P>0.05,見表1)。

表1喉鱗癌中HIF-1α蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Table1RelationshipbetweenclinicopathologiccharacteristicandHIF-1αproteinexpressioninlaryngealsquamouscellcarcinoma

臨床病理參數(shù)nHIF-1α陽(yáng)性陰性χ2P年齡0.1790.672 <60歲644123 ≥60歲583523性別0.05130.821 男性1167244 女性642臨床分型0.919650.631 聲門上型784731 聲門型21138 聲門下型312T分期9.2710.0023 T1+T2431924 T3+T4795722淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17.5442.81×10-5 無804238 有33312

3　討論

喉癌是耳鼻喉科最常見的惡性腫瘤之一,喉部位置特殊、解剖復(fù)雜、功能重要、存在3個(gè)胚葉組織,這些都增加了對(duì)喉鱗癌治療的復(fù)雜性。盡管喉癌治療方法在不斷改進(jìn),但喉癌患者的生存率與生存質(zhì)量仍不理想。目前對(duì)喉癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚,仍需要更加深入地研究和了解。

組織芯片,又稱組織微陣列(tissue microarray,TMA),是一種近年來興起的病理技術(shù),它將數(shù)十個(gè)、數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)小的組織片整齊地排列在某一載體上而成的縮微組織切片。在一張組織芯片切片上可高通量獲取組織學(xué)、基因和蛋白表達(dá)的信息。組織芯片具有高效、快速、低消耗、自身內(nèi)對(duì)照和可比性強(qiáng)的特點(diǎn)。組織芯片的應(yīng)用范圍廣,可作為一種大樣本的研究工具進(jìn)行相關(guān)研究,如免疫組織化學(xué)、原位雜交、熒光原位雜交等,為基因表達(dá)的檢測(cè)、疾病早期診斷、藥物的篩選等提供高通量有效的方法。

血管生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白,在腫瘤新生血管生成中起一定的促進(jìn)作用。近年來低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在惡性腫瘤中的研究作用受到廣泛關(guān)注,已有研究[3,4]證實(shí),在乳腺癌、宮頸癌、食管癌等實(shí)體瘤中HIF-1α呈過度表達(dá),且HIF-1α過度表達(dá)可能與患者不良預(yù)后相關(guān)。HIF-1α在喉癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的相關(guān)研究仍很有限且存在爭(zhēng)議。

2016年張衛(wèi)平等[5]對(duì)喉癌組織中HIF-1α的表達(dá)與臨床意義進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià),研究中作者全面系統(tǒng)檢索國(guó)內(nèi)外發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn),發(fā)現(xiàn)共5篇[6-10]相關(guān)研究,其中喉癌組織202例,正常癌旁組織75例。研究結(jié)果顯示:HIF-1α蛋白在喉癌組織中表達(dá)較其在正常組織中表達(dá)高,在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中的表達(dá)較在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉癌組織中表達(dá)高,中低分化喉癌組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)較高分化的喉癌組織明顯增高;臨床Ⅲ-Ⅳ期喉癌患者喉癌組織中HIF-1α蛋白的表達(dá)較Ⅰ-Ⅱ期喉癌患者喉癌組織中HIF-1α表達(dá)明顯增高。提示HIF-1α蛋白的表達(dá)與喉癌的發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)及臨床分期密切相關(guān)。同時(shí)研究者指出:有關(guān)HIF-1α在喉癌組織中表達(dá)的相關(guān)文獻(xiàn)及樣本量均較少,仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量與更優(yōu)的研究設(shè)計(jì)方案來證實(shí)HIF-1α與喉癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系,以便尋找抗喉癌藥物新的治療靶點(diǎn)。

本研究采用組織芯片技術(shù)對(duì)138例喉鱗癌組織進(jìn)行HIF-1α蛋白免疫組織化學(xué)檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白在喉癌旁細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05);伴隨著喉癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)和TNM分期越高,HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)也越高。HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤位置、患者年齡、性別無關(guān)(P>0.05)。與已有相關(guān)研究結(jié)果一致[5-10]。

綜上所述,在喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移過程中HIF-1α具有重要作用,對(duì)喉鱗癌組織中HIF-1α的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),可作為判斷喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)行為的參考指標(biāo)之一。

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