阿司匹林對匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬異常神經(jīng)發(fā)生的影響

崔小麗,山　媛,袁　婕,趙　瑞,馬　妮,呂　樺

(陜西省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科,西安　710068；*通訊作者,E-mail:lvh2113@163.com)

癲癇是一組由不同病因引起,腦部神經(jīng)元高度同步化,且常具自限性的異常放電所致,以發(fā)作性、短暫性、重復(fù)性及刻板性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的綜合征。Eriksson和其同事在1998年初次提出人腦內(nèi)有神經(jīng)再生。在難治性顳葉癲癇患者病理標(biāo)本中可以發(fā)現(xiàn)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞。癲癇持續(xù)狀態(tài)以后幾天就會看到神經(jīng)發(fā)生,幾周以后還會保持高水平。動物在正常情況下,其新生神經(jīng)元接受功能性傳入信息,繼而將信號傳出到突觸后神經(jīng)元。在癲癇哺乳動物腦組織發(fā)現(xiàn)新生神經(jīng)元異位遷移,異位到門區(qū),形成異常的神經(jīng)環(huán)路,提高神經(jīng)元的興奮性,導(dǎo)致癲癇的反復(fù)發(fā)作。癲癇發(fā)作后,海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生水平出現(xiàn)明顯改變。這一現(xiàn)象為探討癲癇后海馬結(jié)構(gòu)和功能可塑性的變化提供全新思路,也為癲癇的治療帶來新的曙光。阿司匹林對癲癇發(fā)生過程中神經(jīng)發(fā)生有何作用尚不清楚。本實驗采用氯化鋰-匹羅卡品致癲癇大鼠模型,觀察非甾體抗炎藥阿司匹林對匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬異常神經(jīng)發(fā)生的調(diào)控研究。

1　材料和方法

1.1　主要試劑

氯化鋰(廣東西隴化工廠);匹羅卡品(Sigma-Aldrich);溴甲基東莨菪堿(Sigma-Aldrich);水合氯醛(上海山浦化工有限公司);阿司匹林(Sigma-Aldrich);地西泮注射液(西安利君精華藥業(yè)有限公司);小鼠抗BrdU抗體(Santa Cruz Biotechnology);羊抗DCX抗體(Santa Cruz Biotechnology);生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(Vector laboratories,Burlingame,CA);生物素標(biāo)記的兔抗羊IgG(Vector laboratories,Burlingame,CA);生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(Sigma-Aldrich)。

1.2　實驗動物及分組

雄性SD大鼠75只,清潔級,體質(zhì)量200-250 g,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,飼養(yǎng)于12 h/12 h光暗環(huán)境(8:00-20:00),自由飲水,給予標(biāo)準(zhǔn)飲食。所有的動物實驗處理嚴(yán)格按照國家健康協(xié)會制定的實驗動物護理和使用指南。75只大鼠隨機等分為正常對照組、模型組、0 h阿司匹林干預(yù)組、3 h阿司匹林干預(yù)組和24 h阿司匹林干預(yù)組(癲癇持續(xù)狀態(tài)持續(xù)70 min,地西泮注射液終止發(fā)作,終止后的即刻給予阿司匹林干預(yù)定為0 h阿司匹林干預(yù)組,終止后的3 h、24 h分別開始給藥,定為3 h阿司匹林干預(yù)組和24 h阿司匹林干預(yù)組)。

1.3　氯化鋰-匹羅卡品致大鼠癲癇模型

大鼠腹腔注射氯化鋰(3 meq/kg,美國Sigma公司),間隔18-20 h腹腔注射匹羅卡品(30 mg/kg,美國Sigma公司),在注射匹羅卡品前15-20 min大鼠給予皮下注射溴甲基東莨菪堿(1 mg/kg)以減少外周膽堿能反應(yīng)。注射匹羅卡品后約15 min大鼠會出現(xiàn)行為學(xué)變化,行為變化的記錄和等級依照Racine評分標(biāo)準(zhǔn)[1]:0級,無任何反應(yīng);1級,行為固定,面肌抽搐;2級,點頭和濕狗樣動作;3級,雙側(cè)前肢陣攣;4級,前肢陣攣和后肢站立;5級,站立并摔倒。大鼠出現(xiàn)連續(xù)的四級以上發(fā)作持續(xù)70 min,給予地西泮終止發(fā)作。建模時對照組腹腔注射給予等量生理鹽水。終止發(fā)作半小時后,每只大鼠皮下注射生理鹽水10 ml,減少大鼠的死亡率,補充建模時的消耗。造模后前2 d,給予大鼠糊狀常規(guī)鼠糧。

1.4　阿司匹林干預(yù)及分組

將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、0 h阿司匹林(20 mg/kg,腹膜腔內(nèi)注射1次/d)干預(yù)組、3 h阿司匹林干預(yù)組、24 h阿司匹林干預(yù)組,阿司匹林溶于含5%二甲基亞砜(5%DMSO)的生理鹽水,各組都是連續(xù)給藥20 d,對照組和模型組都是給予等量的含5%DMSO的生理鹽水。

1.5　BrdU給藥方法

建模癲癇發(fā)作后第6天大鼠腹腔注射BrdU 10 mg/ml(50 mg/kg,Sigma公司),每12 h一次,共4次。BrdU末次注射后28 d處死大鼠,觀察新生細(xì)胞的分化遷移情況。

1.6　標(biāo)本制備

于實驗設(shè)計的時間點,將各實驗組大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉,迅速開胸暴露膈肌,小心挑破膈肌顯露心臟,剝離心包膜,經(jīng)左心室進入主動脈,固定針頭,剪破右心耳,迅速灌注。首先灌注生理鹽水150 ml沖去血液,然后用4%多聚甲醛(4 ℃,pH=7.4)固定,先快速灌注200 ml,再慢速灌注200 ml。開顱取腦,將腦組織入4%多聚甲醛后固定4 h,再入30%蔗糖,放置在4 ℃,直到組織沉底。冰凍切片機恒溫,將腦組織中的海馬部分冠狀位連續(xù)切片,片厚30 μm。每只大鼠隔5張腦片取一張組成一套,每套10張腦片,共6套。預(yù)做免疫組織化學(xué)染色的入0.01 mol/L PBS中,其他的入凍存液(60%丙三醇:40% 0.01 mol/L PBS),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7　免疫組織化學(xué)染色

BrdU染色:切片依次入下列流程:0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;50%甲酰胺/2×標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽-氯化鈉液(standard saline citrate,SSC)=1 ∶1,65 ℃,2 h;2×SSC漂洗2次,10 min/次;37 ℃水浴2 mol/L鹽酸30 min;pH=8.5 0.1 mol/L 硼酸10 min;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;80%甲醇 ∶30%雙氧水=1 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;0.01 mol/L PBS ∶0.3%Triton-X100=100 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;切片入小鼠抗BrdU單克隆抗體(1 ∶500,Santa Cruz)室溫24 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;切片入生物素化的羊抗小鼠IgG(1 ∶500,Vector Laboratories,Burlingame,CA)室溫2 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;切片入生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(1 ∶500,Sigma)室溫2 h;0.01 mol/L PBS漂洗3次,10 min/次;葡萄糖氧化酶-DAB顯色。顯色后依次裱片,晾干后酒精梯度脫水,二甲苯透明,樹膠封片。對照組用0.01 mol/L PBS代替抗體稀釋液,其余同上,結(jié)果均為陰性。抗體稀釋液為含1%胎牛血清白蛋白和0.3% Triton-X100的0.01 mol/L PBS。

DCX染色:漂片依次入下列溶液:0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次),80%甲醇 ∶雙氧水=100 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次),0.01 mol/L PBS ∶30% Triton=100 ∶1 30 min;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次);漂片入含羊抗DCX(1 ∶500,Santa Cruz Biotechnology)的抗體稀釋液中,室溫孵育24 h,0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次);再入生物素化的兔抗羊IgG(1 ∶500,Vector laboratories,Burlingame,CA)中,室溫孵育2 h;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次),生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(1 ∶500,Sigma-Aldrich),室溫孵育2 h;0.01 mol/L PBS洗滌3次(10 min/次);葡萄糖氧化酶-DAB法顯色。顯色后依次裱片,晾干后酒精梯度脫水,二甲苯透明,樹膠封片。對照組用0.01 mol/L PBS代替抗體稀釋液,其余同上,結(jié)果均為陰性。

1.8　統(tǒng)計學(xué)分析

BrdU計數(shù)采用雙盲法,于BX-51,Olympus顯微鏡200倍下觀察并計數(shù)門區(qū)內(nèi)BrdU陽性細(xì)胞數(shù),結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各均數(shù)之間的比較采用One-way ANOVA,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對所有DCX陽性細(xì)胞,計數(shù)新生神經(jīng)元門區(qū)基數(shù)突數(shù)量并測量基數(shù)突長度。用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果

2.1　行為學(xué)表現(xiàn)

大鼠在腹腔注射匹羅卡品后5 min內(nèi),出現(xiàn)搔抓、流涎、腹瀉等外周反應(yīng);10-15 min出現(xiàn)面部陣攣,包括眨眼、動須、節(jié)律性咀嚼和點頭等Ⅱ級以上的表現(xiàn)，約20 min后出現(xiàn)前肢痙攣,后肢站立并摔倒等Ⅳ級以上的發(fā)作表現(xiàn)。

2.2　阿司匹林干預(yù)后減少了新生細(xì)胞向門區(qū)的異常遷移

BrdU末次注射28 d處死大鼠行免疫組化,各實驗組新生細(xì)胞在齒狀回內(nèi)的分布有明顯的差異(見圖1)。正常組和阿司匹林干預(yù)組中,BrdU陽性細(xì)胞呈圓形或橢圓形,主要分布于亞顆粒增生帶和顆粒細(xì)胞層;模型組中BrdU陽性細(xì)胞主要分布于門區(qū)(見圖1)。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果定量分析表示,模型組門區(qū)BrdU陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,與其他組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而各干預(yù)組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。該結(jié)果表明癲癇發(fā)作后新生細(xì)胞出現(xiàn)向門區(qū)的異常遷移;阿司匹林干預(yù)能夠明顯地減少這種異常遷移。

2.3　阿司匹林干預(yù)后顯著減少SE后門區(qū)內(nèi)DCX陽性突起的數(shù)量和長度

正常情況下DCX主要分布于亞顆粒增生帶,突起伸向分子層。BrdU注射28 d后,新生神經(jīng)元表現(xiàn)出異常遷移模式,形成異位門區(qū)基樹突和門區(qū)異位神經(jīng)元(見圖2)。模型組的突起有一部分伸向了門區(qū);模型組DCX向門區(qū)的異位遷移明顯的增加,阿司匹林干預(yù)后,新生神經(jīng)元向門區(qū)的遷移較模型組減少,突起的數(shù)量和突起的長度都較模型組減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3，4),而各干預(yù)組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。正常對照組、模型組、0 h Asp干預(yù)組、3 h Asp干預(yù)組、24 h Asp干預(yù)組突起的數(shù)量分別為10.0±6.45，184.67±19.86，33.33±10.09，28.67±7.53，28.20±8.44(見圖3)；突起的長度分別為(173.45±3.46)μm，(2 952.9±636.33)μm，(1 206.3±241.87)μm，(868.20±139.03)μm，(948.87±124.26)μm(見圖4)。

3　討論

癲癇嚴(yán)重地危害著人類的生命,其在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)病率僅次于腦血管病,對個人而言嚴(yán)重地影響其身心發(fā)展,對家庭社會而言無疑是一極大的負(fù)擔(dān)。該病的不可預(yù)知性,更是讓我們難以防范。到目前為止,抗癲癇藥種類繁多,但沒有任一種藥物能夠從根源上解決問題,而仍然有30%癲癇患者發(fā)作癥狀不能得到有效的控制[2],所以全人類亟需找到新的抗癲癇方法,從根源上解決問題,也就是抗癲癇發(fā)生。目前比較公認(rèn)的一種說法是,癲癇發(fā)生或者說潛伏期是一段時期,指在受到創(chuàng)傷如腦損傷、中風(fēng)、持續(xù)的熱性驚厥、癲癇持續(xù)狀態(tài)或腦炎后,出現(xiàn)第一次自發(fā)性發(fā)作之前的一段時期。癲癇發(fā)生的過程中改變了神經(jīng)元的興奮性,確立了主要的內(nèi)部鏈接,以及結(jié)構(gòu)的改變。這些改變包括神經(jīng)變性、神經(jīng)發(fā)生等[3]。癲癇發(fā)生過程中一個重要改變?yōu)樾律窠?jīng)元的異常遷移,大量研究已經(jīng)證實,海馬齒狀回顆粒細(xì)胞的異常整合,其中包括門區(qū)異位顆粒細(xì)胞,是顳葉癲癇的重要病理特征[4],在癲癇持續(xù)狀態(tài)后,新生神經(jīng)元的正常遷移方向受到干擾,這些新生神經(jīng)元形成的基樹突,異常伸向門區(qū),在門區(qū)內(nèi)無序排列,形成門區(qū)的異位神經(jīng)元,有研究發(fā)現(xiàn)[5],這些新生神經(jīng)元在電生理特性及形態(tài)上與齒狀回的顆粒細(xì)胞非常相似,但與成熟的顆粒細(xì)胞不同的是,門區(qū)異位神經(jīng)元可以與海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞同步,產(chǎn)生異常爆發(fā)點燃,氯化鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中,給予抗有絲分裂抑制劑,可以抑制海馬神經(jīng)發(fā)生,進而減少門區(qū)異位神經(jīng)元的形成,最終降低癲癇發(fā)作的頻率。也有研究表明癲癇持續(xù)狀態(tài)后齒狀回新生顆粒神經(jīng)元爆發(fā)性增加,這些新生神經(jīng)元同時表現(xiàn)出異常遷移[6]，導(dǎo)致形成異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),興奮性環(huán)路重組,腦的興奮性與抑制性失平衡,這使得神經(jīng)細(xì)胞過度興奮及高度同步化,導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作。

圖1　阿司匹林對癲癇大鼠海馬齒狀回內(nèi)BrdU標(biāo)記新生細(xì)胞表達的影響Figure 1　Effect of aspirin on BrdU labeling newborn cells in hippocampal dentate gyrus(DG) of epileptic rats

A.正常對照組；B.癲癇模型組； C.0 h Asp干預(yù)組；D.3 h Asp干預(yù)組；E.24 h Asp干預(yù)組(scale bar=100 μm);　F.B圖方框部位的放大(Scale bar=50 μm)圖2　阿司匹林對癲癇大鼠海馬齒狀回內(nèi)DCX標(biāo)記新生神經(jīng)元遷移表達的影響Figure 2　Effect of aspirin on aberrant migration of DCX-labeled newborn cells in hippocampal dentate gyrus(DG) of epileptic rats

與Control組相比,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01圖3　阿司匹林干預(yù)對SE后門區(qū)內(nèi)DCX陽性突起的數(shù)量的影響Figure 3　Effect of aspirin on DCX-positive dendritic processes reaching into the hilus after SE

與Control組相比,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01圖4　阿司匹林干預(yù)對SE后門區(qū)內(nèi)DCX陽性突起長度的影響Figure 4　Effect of aspirin on the length of DCX-positive dendritic processes reaching into the hilus after SE

近期發(fā)現(xiàn)癲癇的發(fā)生過程中炎性因子起了重要作用[7],在癲癇患者的標(biāo)本和動物實驗中都觀察到有炎性分子的大量表達。在炎癥存在的情況下癲癇發(fā)作的閾值減低。炎癥分子在不同程度上影響神經(jīng)元的興奮性,機制之一為,IL-1β和TNF通過阻斷星型膠質(zhì)細(xì)胞對谷氨酸的再攝取[8],增加了細(xì)胞外谷氨酸的濃度,同時也促進了星型膠質(zhì)細(xì)胞釋放谷氨酸。此外,細(xì)胞因子和前列腺素物質(zhì)還調(diào)節(jié)電壓門控和受體門的離子通道的功能。如果在癲癇發(fā)生的潛伏期進行干預(yù),那么癲癇發(fā)生的病理變化將被控制,后期也將可能不會有癲癇自發(fā)發(fā)作。抗炎藥阿司匹林能否改變癲癇發(fā)生過程中的病理變化,從根源上控制癲癇還沒有詳細(xì)的被證明。本實驗中我們利用氯化鋰-匹羅卡品致癲癇大鼠模型,在靜默期給予抗炎藥阿司匹林干預(yù),觀察癲癇形成過程中的結(jié)構(gòu)病理變化。在該部分實驗中我們觀察到非甾體抗炎藥阿司匹林有神經(jīng)保護作用,這和以往的報道是一致的[9],減少了海馬神經(jīng)元的丟失。減少神經(jīng)元損傷這一作用對其將來能否應(yīng)用于臨床治療癲癇起很好的支持作用。難治性癲癇患者大部分為耐藥,現(xiàn)有的抗癲癇藥物不能控制其臨床癥狀,這些患者腦內(nèi)大多有一共同的變化,即海馬神經(jīng)元丟失變性。因此在各種傷害性腦損傷誘導(dǎo)腦內(nèi)級聯(lián)事件的發(fā)生,導(dǎo)致癲癇自發(fā)性發(fā)作之前給予神經(jīng)保護性藥物或許能夠減少后期的自發(fā)性發(fā)作。與本課題組的既往研究一致[10],在該實驗中我們還發(fā)現(xiàn),癲癇組大鼠海馬新生神經(jīng)元出現(xiàn)向門區(qū)的異常遷移,這些異位的神經(jīng)元成為癲癇反復(fù)發(fā)作的新的靶點。海馬區(qū)異常的神經(jīng)發(fā)生導(dǎo)致了癲癇發(fā)作及認(rèn)知功能下降[11],本研究的結(jié)果表明,抗炎藥阿司匹林干預(yù)明顯地減少了神經(jīng)元的異常遷移,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。成年海馬部位亞顆粒增生帶還可以產(chǎn)生新的細(xì)胞,神經(jīng)前體細(xì)胞從亞顆粒細(xì)胞層呈放射狀遷移至海馬顆粒細(xì)胞層的基底部,在此神經(jīng)前體細(xì)胞分化為顆粒細(xì)胞,進而建立突觸聯(lián)系[12]。癲癇發(fā)作后,這些異位入門區(qū)的神經(jīng)元與CA3區(qū)的錐體神經(jīng)元整合成新的網(wǎng)絡(luò),可能導(dǎo)致后期癲癇的自發(fā)性發(fā)作。這些異位的神經(jīng)元還可和苔蘚纖維建立連接[13],進而導(dǎo)致自發(fā)爆發(fā)動作電位。癲癇發(fā)生后,海馬新生神經(jīng)元出現(xiàn)異位遷移的確切機制尚未闡明,近來研究表明細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Reelin使神經(jīng)元朝著正常的方向遷移[14],在匹羅卡品致癲癇大鼠模型中,研究發(fā)現(xiàn)Reelin表達下降,因此上調(diào)Reelin或許可以減少齒狀回神經(jīng)發(fā)生和新生神經(jīng)元的異常遷移。目前我們課題組發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)作后門區(qū)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可能指導(dǎo)了新生神經(jīng)元的異常遷移,給予小膠質(zhì)細(xì)胞的抑制劑米諾環(huán)素可以阻斷新生神經(jīng)元向門區(qū)的異常遷移[15]。但哪種機制是最重要的,需要下一步實驗的進一步證實。

綜上本實驗表明抗炎藥阿司匹林能夠減少新生神經(jīng)元的異常遷移。阿司匹林上述作用可能使得其能夠減少癲癇反復(fù)自發(fā)發(fā)作,給臨床治療提供了一定的參考價值?？寡姿幨峭ㄟ^什么途徑影響了癲癇發(fā)生過程中的病理變化也是一個很有意義的課題,在今后的實驗中我們將會從分子水平進一步闡述,以期為臨床預(yù)防與治療難治性癲癇提供依據(jù)。

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