馮 俊,李 麗,楊久梅,彭 濤
(1川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院耳鼻咽喉科,南充 637007;2川北醫(yī)學(xué)院病理教研室;*通訊作者,E-mail:fjlx8888@163.com)
喉癌是耳鼻咽喉科常見病、多發(fā)病,最常見的病理類型為高分化鱗狀細(xì)胞癌,隨著環(huán)境污染加劇其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢,占頭頸惡性腫瘤的第三位,已成為嚴(yán)重危害人類生命健康的頭頸惡性腫瘤之一[1]。由于晚期的喉癌病人失去了手術(shù)機(jī)會,以及喉鱗癌對放射治療、藥物化療不敏感,臨床中迫切需要新的治療方法來延長病人的生命。隨著技術(shù)的發(fā)展,基因治療成為晚期腫瘤患者的選擇之一。anti-Livin核苷酸在體外能抑制喉鱗狀細(xì)胞癌中Livin的表達(dá)[17]。Livin(IAPs,inhibitor of a apoptosis protein)是凋亡抑制蛋白家族中的成員之一,與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[2,3]。本研究利用anti-Livin核苷酸調(diào)低喉鱗癌裸鼠移植瘤內(nèi)Livin的表達(dá)量,探討其對喉鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。
雌性裸鼠(BALB/c-nu/nu)28只,2-3周齡,體重20-22 g,購于四川大學(xué)華西動物中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(川)2013-026。Hep-2細(xì)胞株由川北醫(yī)學(xué)院分子生物研究所贈送。
RPMI-1640(按說明書配制,含HEPES 25 mmol/L,谷胺酞胺2 mmol/L,直徑0.22 μm濾器過濾除菌,臨用前加入10%新鮮滅活的胎牛血清,青霉素100 U/ml,鏈霉素100 μg/ml),Lipofectamine 2000、GAPDH monoclonal antibody購自美國Santa Cruz公司;Livin單克隆抗體購自中國Takara公司,TUNEL試劑盒購自美國Roche公司;PVDF膜購自美國Millipore公司;BCIP/NBT購自中國Takara公司。
Livin基因序列(序列號:NM-022161)于NCBIGenBank庫獲得,根據(jù)干擾分子生物學(xué)原理,設(shè)計(jì)、篩選出3個(gè)以上有效靶點(diǎn)序列,選取干擾效率高的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最優(yōu)靶點(diǎn)序列為BIRC7-SH2:Sen-DNs(正義Livin核苷酸):5′-GCCCTGTCCTAGGCCTGGACA-3′;AS-DNs(反義Livin核苷酸):5′-TGTCCAGGCCTAGGACAGGGC-3′;Mis-DNs(錯(cuò)配Livin核苷酸):5′-CAGATGTAGACCATCAGTCTA-GAAC-3′;核苷酸序列由上海生工生物工程有限公司合成。
于SPF級無菌室飼養(yǎng)裸鼠,室內(nèi)定期消毒滅菌。于Hep-2細(xì)胞生長達(dá)70%-80%時(shí),用0.25%胰酶消化、PBS混懸,制成1×105/ml瘤細(xì)胞懸液3-4 ml,放在37 ℃,5% CO2孵箱備用;采用碘伏在裸鼠背側(cè)部消毒,皮下注射Hep-2細(xì)胞懸液0.1 ml(約含細(xì)胞1×105個(gè));裸鼠于SPF級無菌室繼續(xù)飼養(yǎng),觀察裸鼠皮膚顏色變化、進(jìn)飼情況、活動規(guī)律變化等生理指標(biāo)。測量腫瘤長徑和短徑變化,按公式腫瘤體積=(長徑×短徑2)π/6計(jì)算,將腫瘤體積變化繪制成生長曲線。約接種后7 d,腫瘤體積長到200 mm3時(shí),分為4組:對照組、Sen-DNs組、Mis-DNs組和AS-DNs組,每組7只。采用裸鼠移植瘤體內(nèi)分組注射不同藥物。AS-DNs組:每只裸鼠移植瘤內(nèi)注射2.5 mg/kg的Livin AS-DNs懸液0.1 ml;Sen-DNs組:每只裸鼠移植瘤內(nèi)注射2.5 mg/kg的Livin Sen-DNs懸液0.1 ml;Mis-DNs組:每只裸鼠移植瘤內(nèi)注射2.5 mg/kg的Livin Mis-DNs懸液0.1 ml;對照組:每只裸鼠移植瘤內(nèi)注射0.1 ml生理鹽水;每次多點(diǎn)注射,每次間隔時(shí)間為5 d,再次取不同部位注射,共3次。末次注射后第3周,乙醚麻醉后斷頸處死,取移植瘤液氮保存?zhèn)溆谩?/p>
將1.4所述各組瘤體組織分別集中勻漿后將勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管,4 ℃離心5 min,收集上清液,再次離心,取上清,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,棄沉淀,煮沸樣品10-15 min,離心5 min,共離心3次,以Bradford法檢測上清液的蛋白濃度調(diào)整上清液體積,PVDF膜正反面作標(biāo)記,用PBS(含3%脫脂奶)封閉液,在室溫下封閉6-8 h,PBS液清洗10 min×3次。加一抗Livin單克隆抗體(1 ∶500),加GAPDH(1 ∶3 000),常溫培育1.5 h,PBST洗滌4次,每次15 min,加HRP標(biāo)記的二抗,常溫培育1 h,用15 ml TBS清洗1次,過15 min,再用15 ml TBS洗4次,每次清洗5 min。加入BCIP/NBT試劑顯色、室溫培育2 min。暗室膠片顯影、定影、掃描。
常規(guī)石蠟切片4 μm,用3% H2O2室溫反應(yīng)30 min,PBS洗3 min×3次,4%多聚甲醛溶液,室溫放置15 min,PBS洗2次。100 μl 20 μg/ml的蛋白酶K以覆蓋組織切片,室溫孵育20 min,PBS洗3 min×3次。TUNEL混合液1 ml,37 ℃培育1 h,PBS洗3 min×3次,抗生物素蛋白鏈菌素辣根過氧化物酶液(Streptavidin-HRP)100 μl,在37 ℃培育30 min,0.04% DAB+0.3%H2O2顯色約10 min,蘇木精復(fù)染1 min。計(jì)算AI(apoptotic index):AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總的有核細(xì)胞數(shù)。
由圖1可見,AS-DNs組的Livin蛋白相對表達(dá)量最低[(15.02±1.68)%],Mis-DNs組、Sen-DNs組、Control組的Livin蛋白相對表達(dá)量分別為(54.56±2.45)%、(52.60±1.85)%、(55.51±2.92)%;AS-DNs組與Sen-DNs組、Mis-DNs組、Control Livin蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mis-DNs、Control、Sen-DNs組兩兩之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
與其他三組比較,*P<0.05圖1 各組移植瘤中Livin蛋白的表達(dá)量Figure 1 The Livin protein relative quantity in transplanted tumor in vivo was detected by Western blott.
用TUNEL法檢測不同組移植瘤細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示AS-DNs組瘤體組織細(xì)胞內(nèi)見大量含凋亡小體的細(xì)胞,Mis-DNs組、Sen-DNs組、Control組瘤體內(nèi)見少量含凋亡小體的細(xì)胞(見圖2);Mis-DNs組、Sen-DNs組、Control組的凋亡指數(shù)分別為(4.33±1.52)%、(6.21±2.1)%和(5.01±2.1)%,三者之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS-DNs組裸鼠移植瘤體內(nèi)喉鱗癌細(xì)胞的凋亡指數(shù)最高為(20.15±3.1)%,與Mis-DNs組、Sen-DNs組、Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2)。
采用AS-DNs治療組的腫瘤曲線斜率較小,曲線較平坦,腫瘤細(xì)胞生長緩慢;Sen-DNs組、Mis-DNs組、Control組腫瘤曲線斜率較大,曲線較陡,腫瘤細(xì)胞生長較快(見圖3);AS組與Sen-DNs組、Mis-DNs組、Control組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Mis-DNs組、Sen-DNs組、Control組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
Livin是常見與細(xì)胞凋亡有關(guān)的基因,屬于凋亡抑制蛋白家族中的一員,其基因位于人類第20號染色體,共46 kb。Livin蛋白由BIR結(jié)構(gòu)的N端,及RING結(jié)構(gòu)C端構(gòu)成,其活性區(qū)是BIR區(qū),與Livin蛋白表達(dá)、細(xì)胞的凋亡相關(guān)[4-6]。Livin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是:通過激活TAKI/JNK1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抗凋亡;抑制caspase途徑:Livin能與caspase前體蛋白和其激活形式結(jié)合從而抑制其功能,阻斷其級聯(lián)反應(yīng)從而抑制凋亡的進(jìn)程,阻礙多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[7-9]。Yang等[10]通過siRNA抑制膀胱癌T24細(xì)胞Livin蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)T24細(xì)胞生長抑制及凋亡。Livin基因還在乳腺癌、宮頸癌、鼻咽癌、黑色素瘤、肺癌組織、結(jié)腸癌組織中有表達(dá)[11-16]。Feng等[17]研究顯示在喉鱗癌細(xì)胞中可檢測到Livin mRNA的高表達(dá),通過抑制Livin的表達(dá),在體外促進(jìn)了喉鱗癌細(xì)胞的凋亡。Ge等[18]研究提示Livin在大腸癌中高表達(dá),并且通過NF-κB活化誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。
與其他三組比較,*P<0.05圖2 各組移植瘤細(xì)胞凋亡情況Figure 2 The apoptosis of laryngeal squamous cell carcinoma cell in different group by TUNELs
圖3 不同干預(yù)下喉鱗癌細(xì)胞移植瘤的生長曲線變化Figure 3 Growth curve of transplant tumor of Hep-2 cells after different treatment
本研究顯示,用Western blot分析各組移植瘤的Livin蛋白時(shí),AS組的Livin蛋白表達(dá)量較低[(15.02±1.68)%],這可能是由于反義Livin多核苷酸抑制了Livin的表達(dá),進(jìn)而促使裸鼠移植瘤細(xì)胞mRNA、Livin蛋白的降低;而Sen-DNs組、Mis-DNs組、Control組的Livin蛋白表達(dá)量較高,這可能是由于Sen-DNs組、Mis-DNs組多核苷酸對Livin無抑制作用,故AS-DNs組Livin蛋白與Sen-DNs組、Mis-DNs組、Control組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sen-DNs組、Control組、Mis-DNs組間兩兩比較,Livin蛋白無顯著差異。本研究揭示anti-Livin核苷酸在裸鼠移植瘤內(nèi)可以減少Livin蛋白表達(dá),與Feng等[13]的體外實(shí)驗(yàn)吻合。AS-DNs組瘤體組織細(xì)胞內(nèi)見大量含凋亡小體的細(xì)胞,提示組織細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡,而其他組瘤體內(nèi)見少量凋亡小體的細(xì)胞;Livin AS-DNs組的凋亡指數(shù)顯著高于其他組,提示AS-DNs能促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞凋亡。而采用AS-DNs治療組的腫瘤生長較Sen-DNs組、Mis-DNs組、Control組慢,可能是反義Livin多核苷酸促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞凋亡從而對腫瘤的生長有顯著抑制作用。動物實(shí)驗(yàn)顯示anti-Livin核苷酸促進(jìn)了裸鼠移植瘤喉癌細(xì)胞的凋亡。
本研究結(jié)果表明,反義Livin多核苷酸能調(diào)低喉鱗癌組織中Livin表達(dá),在裸鼠移植瘤內(nèi)增加喉鱗癌細(xì)胞的凋亡,抑制了腫瘤的生長。為將潛在的基因治療運(yùn)用于喉鱗癌病人提供依據(jù),這一方法亦可能潛在用于臨床其他腫瘤的研究和治療。
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山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2018年2期