辛伐他汀對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖凋亡的影響及其機(jī)制

方倩茹,梁　冰,王效靜,酈憶文*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院老年病科,蚌埠　233004;2呼吸系病臨床基礎(chǔ)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:yuhangfeng@629sina.com)

肺癌是世界上最常見、死亡率最高的惡性腫瘤之一[1],其中非小細(xì)胞肺癌占到80%-85%。統(tǒng)計(jì)表明,非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率極低,約為15%[2],原因是患者早期癥狀不明顯,發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期,缺乏及時(shí)有效的治療。

辛伐他汀為羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,能夠抑制甲羥戊酸途徑,減少體內(nèi)膽固醇的合成,臨床上主要用于降脂治療,預(yù)防心腦血管疾病發(fā)生。有研究表明,甲羥戊酸途徑在很多方面參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展,包括腫瘤細(xì)胞的增殖,腫瘤的侵襲,腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等[3]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),辛伐他汀可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,如乳腺癌、前列腺癌、肝癌等,具有較好的抗腫瘤作用[4,5]。辛伐他汀對(duì)肺癌細(xì)胞亦有顯著的細(xì)胞毒活性[6],并且能夠誘導(dǎo)和加強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡[7],然而,對(duì)于辛伐他汀誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡具體途徑以及分子水平變化的影響仍不清楚。本研究通過(guò)體外用辛伐他汀處理非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞,觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)以及測(cè)定相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變,探討辛伐他汀誘導(dǎo)A549細(xì)胞增殖抑制和發(fā)生凋亡的可能分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　細(xì)胞株與主要試劑

A549細(xì)胞株由蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重學(xué)科實(shí)驗(yàn)室提供,辛伐他汀原料藥購(gòu)自上海TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司,胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司、C003細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒、增強(qiáng)型BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司,Annexin Ⅴ-FITC/PI流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自貝博生物科技有限公司,GAPDH購(gòu)自廣州賢至生物科技有限公司,兔抗人XIAP、兔抗人GRP78和兔抗人caspase-3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司。

1.2　細(xì)胞培養(yǎng)

將非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株常規(guī)復(fù)蘇后,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5% CO2,95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代,每2 d更換培養(yǎng)基,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3　細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,以每孔3 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板,加入100 μl含10,20,30,40 μmol/L辛伐他汀,每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,并設(shè)置空白對(duì)照組,放入37 ℃,5% CO2,95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別于24,48,72 h后,向每孔中加入10 μl的CCK-8,在酶標(biāo)儀上450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-各處理組的吸光度值/對(duì)照組的吸光度值)×100%。

1.4　Hoechst-33528熒光染色

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔板(5×104/ml,2 ml/孔),細(xì)胞貼壁后,用10,20,30,40 μmol/L濃度的辛伐他汀作用于細(xì)胞48 h后,棄去培養(yǎng)液,加入固定液固定10 min,用PBS清洗,加入熒光染色劑1 ml/孔,染色10 min。再PBS洗3次,吸去多余液體,于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組,每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)3次。凋亡率為單視野中100個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞數(shù)目,即凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,接種至6孔板(調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/ml,2 ml/孔),再用不同濃度辛伐他汀0,20,40 μmol/L作用于細(xì)胞48 h,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,每組3個(gè)復(fù)孔。消化收集細(xì)胞,取5×104細(xì)胞于195 μl的結(jié)合液中,加入5 μl FITI、5 μl PI后再加入145 μl結(jié)合液,同時(shí)對(duì)照組加入含有細(xì)胞的195 μl的結(jié)合液,以及155 μl結(jié)合液,混勻,室溫避光染色15 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6　蛋白免疫印跡法檢測(cè)XIAP、caspase-3和XIAP78蛋白的表達(dá)

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞,用辛伐他汀濃度為0,20,40 μmol/L的培養(yǎng)液處理48 h,提取各組細(xì)胞總蛋白,并測(cè)定蛋白濃度。取出30 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE膠電泳,使用插電轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,將GAPDH(1 ∶500)作為內(nèi)參,加入待檢測(cè)的XIAP(1 ∶1 000),Caspase-3(1 ∶1 000)和GRP78(1 ∶1 000)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜,加入相應(yīng)二抗(1 ∶10 000),室溫孵育2 h,TBST洗3次,倒入顯影劑,孵育3 min,進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng),并拍照獲取圖片,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1　細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在藥物辛伐他汀的作用后,A549細(xì)胞的增殖活性明顯抑制,并且隨著時(shí)間推移,藥物濃度的增高,抑制作用更加明顯。辛伐他汀處理24 h,30 μmol/L,40 μmol/L組活性明顯低于對(duì)照組(P<0.01);處理48 h,辛伐他汀組細(xì)胞活性均低于對(duì)照組(P<0.05);處理72 h,辛伐他汀組細(xì)胞活性明顯低于對(duì)照組(P<0.01,見圖1)。

相同時(shí)間與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖1　不同濃度辛伐他汀處理后細(xì)胞的OD值Figure 1　OD values of cells treated with different concentrations of simvastatin

2.2　Hoechst33528熒光染色顯示辛伐他汀作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

加入不同濃度辛伐他汀(10,20,30,40 μmol/L)作用48 h,顯微鏡下觀察出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,隨著濃度增加凋亡更加明顯;光學(xué)顯微鏡下,Hoechst33528熒光染色后,與對(duì)照組相比可見細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)典型的凋亡改變,細(xì)胞縮小,細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮出現(xiàn)致密濃染,顏色發(fā)白,正常細(xì)胞核則為正常淡藍(lán)色(見圖2)。細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)48 h處理后,20,30,40 μmol/L組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖3)。

A.空白對(duì)照組　　　B.10 μmol/L辛伐他汀C.20 μmol/L辛伐他汀D.30 μmol/L辛伐他汀　E.40 μmol/L辛伐他汀圖2　Hoechst33528染色法熒光顯微鏡下細(xì)胞凋亡Figure 2　Hoechst33528 staining of cell apoptosis under fluorescence microscopy

與對(duì)照組相比,**P<0.01圖3　不同濃度辛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞凋亡率影響Figure 3　Effect of different concentrations of simvastatin on apoptosis rate of A549 cells

2.3　流式細(xì)胞技術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)結(jié)果

流式細(xì)胞技術(shù)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法進(jìn)行染色,正常細(xì)胞不會(huì)被染色,發(fā)生凋亡的細(xì)胞會(huì)被AnnexinⅤ-FITC/PI染色,結(jié)果表明,20 μmol/L、40 μmol/L辛伐他汀組與對(duì)照組細(xì)胞相比,凋亡率明顯升高(見圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,辛伐他汀處理48 h,對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(17.68±0.59)%,辛伐他汀濃度20 μmol/L組細(xì)胞凋亡率為(27.31±1.37)%,40 μmol/L組細(xì)胞凋亡率為(34.53±0.57)%,兩組凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.4　辛伐他汀對(duì)細(xì)胞內(nèi)XIAP、Caspase-3和GRP78蛋白表達(dá)的影響

蛋白印跡法檢測(cè),辛伐他汀作用48 h,20 μmol/L,40 μmol/L組Caspase-3和GRP78蛋白表達(dá)量均高于0 μmol/L組(P<0.01),XIAP蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖5)。

3　討論

肺癌是對(duì)人類健康以及生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1],并且大多數(shù)肺癌患者經(jīng)確診后已經(jīng)屬于晚期,且治療效果差,死亡率高。X連鎖凋亡抑制蛋白XIAP是IAP家族中結(jié)合并抑制caspases蛋白酶最有效,也是唯一能夠干擾啟動(dòng)性和效應(yīng)性半胱天冬氨酸蛋白酶的蛋白質(zhì),成為了治療惡性腫瘤最有吸引力的靶標(biāo)。

Caspase又稱含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶,是程序性細(xì)胞死亡過(guò)程中的關(guān)鍵介質(zhì),其引起的蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng),能夠選擇性地切割蛋白質(zhì),損傷細(xì)胞DNA,造成細(xì)胞的凋亡。Caspase蛋白酶家族有很多成員,主要包括啟動(dòng)性caspase(caspase-8,9,10)和效應(yīng)性caspase(caspase-3,6,7)等,其中caspase-3是整個(gè)凋亡級(jí)聯(lián)過(guò)程中最重要的蛋白酶,參與細(xì)胞凋亡的兩個(gè)主要途徑[8],其引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)直接影響細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化[9]。IAP蛋白家族主要是通過(guò)BIR1、BIR2、BIR3結(jié)構(gòu)域與Caspase家族介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中位于下游區(qū)的caspase-3與caspase-7,9,選擇性地結(jié)合抑制下游區(qū)caspase活性而發(fā)揮凋亡抑制作用[10]。研究顯示,XIAP能夠通過(guò)抑制caspase-3蛋白酶活性從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,辛伐他汀可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡。隨著辛伐他汀藥物濃度的增加,A549細(xì)胞中XIAP蛋白表達(dá)量逐漸降低,caspase-3蛋白表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(shì),表明了辛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞是通過(guò)降低XIAP對(duì)半胱天冬氨酸蛋白酶的抑制作用,使caspase-3得到活化,造成細(xì)胞的凋亡。

圖4　AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況Figure 4　Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining of the apoptosis

與對(duì)照組相比,**P<0.01圖5　Western-blot檢測(cè)的XIAP,GRP78與Caspase-3蛋白水平的表達(dá)Figure 5　The expression levels of XIAP,GRP78,and Caspase-3 protein by Western-blot

細(xì)胞凋亡的途徑包括線粒體途徑和死亡受體途徑,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)是這兩種凋亡途徑之外被研究者們新發(fā)現(xiàn)的另一種重要的與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)的凋亡途徑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中極為重要的細(xì)胞器,也是細(xì)胞表面蛋白與分泌蛋白的折疊、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要場(chǎng)所。GRP78為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的分子伴侶,也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中重要的調(diào)節(jié)因子[12]。在腫瘤組織中,由于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)速度過(guò)快以及細(xì)胞中蛋白質(zhì)的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)速度加快,加之細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,血液供應(yīng)不足,缺氧,導(dǎo)致了過(guò)多的未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)會(huì)聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,引起未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)。這種未折疊蛋白反應(yīng)會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成,對(duì)細(xì)胞自身進(jìn)行保護(hù)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的壓力過(guò)強(qiáng)或者刺激過(guò)強(qiáng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),超過(guò)了細(xì)胞的處理能力,應(yīng)激通路便會(huì)切換成細(xì)胞凋亡通路,GRP78自身被激活磷酸化,進(jìn)而激活相關(guān)酶和凋亡分子[13],引起一系列凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。本試驗(yàn)中辛伐他汀持續(xù)作用于A549細(xì)胞48 h,GRP78蛋白表達(dá)呈現(xiàn)增高的趨勢(shì),而細(xì)胞凋亡卻逐漸加重,提示辛伐他汀導(dǎo)致A549細(xì)胞凋亡與細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡應(yīng)激通路的激活有關(guān)。

綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)加入不同濃度辛伐他汀干擾后A549細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察,得出辛伐他汀對(duì)A549細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用,并且呈現(xiàn)時(shí)間、濃度依賴性。研究證實(shí)了辛伐他汀誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制,涉及了兩個(gè)方面,一是辛伐他汀可以降低XIAP蛋白對(duì)caspase-3蛋白酶的抑制作用,使caspase-3得以活化,引起半胱天冬氨酸級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;二是辛伐他汀激活了GRP78相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑,促使細(xì)胞發(fā)生凋亡,有關(guān)其作用的具體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路機(jī)制,還需更進(jìn)一步的研究探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]Socinski MA,Obasaju C,Gandara D,etal. Clinicopathologic features of advanced squamous NSCLC[J]. J Thorac Oncol, 2016, 11(9):1411-1422.

[2]Lin JJ,Cardarella S, Lydon CA,etal. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs[J]. J Thorac Oncol, 2016, 11(4):556-565.

[3]Kato S, Smalley S, Sadarangani A,etal. Lipophilic but not hydrophilic statins selectively induce cell death in gynaecological cancers expressing high levels of HMG-CoA reductase[J]. J Cell Mol Med, 2010, 14(5):1180-1193.

[4]Boudreau DM, Yu O, Johnson J. Statin use and cancer risk: a comprehensive review[J]. Expert Opin Drug Saf, 2010, 9(4):603-621.

[5]Osmak M. Statins and cancer: current and future prospects[J]. Cancer Lett, 2012, 324(1):1-12.

[6]Liu B, Yang J. Effects of simvastatin on cell proliferation and immune escape of non-small cell lung cancer[J]. Chin J New Clin Med, 2013, 6(8):729-732.

[7]Park IH, Kim JY, Choi JY,etal. Simvastatin enhances irinotecan-induced apoptosis in human non-small cell lung cancer cells by inhibition of proteasome activity[J]. Invest New Drugs, 2011, 29(5):883-890.

[8]Yu JQ, Bao W, Lei JC. Emodin regulates apoptotic pathway in human liver cancer cells[J].Phytother Res,2013,27(2):251-257.

[9]Glen NC, Hirakawa BP, Fisher CD,etal. Characterizationof the caspase inhibitor IDN-1965 in a model of apoptosis associated liver injury[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2001, 297(2):811-812.

[10]Jin Z, Yan W, Jin H,etal. Psoralidin inhibits proliferation and enhances apoptosis of human esophageal carcinoma cells via NF-kB and P13K/Akt signaling pathways[J]. Oncol Lett, 2016, 12(2):971.

[11]Liu C, WU X, Luo C,etal. Antisense oligonucleotide targeting xiap induces apoptosis of human bladder cancer cell via a mechanism involving caspase-3[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2010, 29(3):63-80.

[12]Pelaia G, Gallelli L, Renda T,etal. Effects of statins and far-nesyl transferase inhibitors on ERK phosphorylation, apoptosis and cell viability in non-small lung cancer cells[J]. Cell Prolif, 2012, 45(6): 557-565.

[13]Liang YW, Chang CC, Hung CM,etal. Preclinical activity of sim-vastatin induces cell cycle arrest in G1 via blockade of Cyclin D-Cdk4 expression in non-small cell lung cancer (NSCLC)[J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(3): 5806-5816.