利用味精副產(chǎn)物開發(fā)生物飼料的研究

周金雨，韓　雋，彭　超

（中糧生化能源（龍江）有限公司,黑龍江齊齊哈爾 161100）

玉米是世界上分布最廣的作物之一，中國是世界第二大玉米生產(chǎn)國和消費(fèi)國。玉米深加工過程中大約會(huì)產(chǎn)生30%的玉米蛋白粉、玉米皮、玉米胚芽粕及DDGS等副產(chǎn)物，大多數(shù)生產(chǎn)企業(yè)將副產(chǎn)物烘干后作為飼料原料出售，產(chǎn)品附加值低、消耗大量能源的同時(shí)也會(huì)造成環(huán)境污染。另外，許多飼料廠、飼養(yǎng)場（戶）無科學(xué)依據(jù)地利用這些副產(chǎn)物，造成原料濫用、浪費(fèi)、效率低的現(xiàn)象十分嚴(yán)重。目前，我國飼糧約占糧食總產(chǎn)量的35%，預(yù)計(jì)到2020和2030年，比重將分別達(dá)到45%和50%，但糧食預(yù)期年增量約有1%，飼糧缺口較大，其中優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料資源將更加緊張，因此，嘗試?yán)眯滦惋暳显洗嫒諠u緊缺的常規(guī)飼料原料會(huì)成為未來飼料發(fā)展的必然趨勢。

我國微生物發(fā)酵制品開始于20世紀(jì)20年代初，但到80年代后才有較快進(jìn)展，其大部分是利用工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中多種可再生資源生產(chǎn)飼料酵母和食用酵母，比如利用味精廠廢液、淀粉廠廢液等為原料，優(yōu)化篩選出可在這些廢液中良好生長的菌種，結(jié)合現(xiàn)代微生物發(fā)酵工程技術(shù)，高密度生產(chǎn)出產(chǎn)品。2001年Winsen提出了液體生物發(fā)酵飼料的指標(biāo)，并被廣大學(xué)者所認(rèn)同，即pH＜4.5、LAB＞9 lg CFU/mL、乙酸含量＜40 mmol/L、乳酸含量＞150 mmol/L、乙醇含量＜0.8 mmol/L。液體生物發(fā)酵飼料的使用已有一段時(shí)間，但國外對(duì)其研究得較為深入（Winsen等，2001）。蔡興旺等（2003）將生物法與氨化法和青貯法處理秸稈進(jìn)行比較，結(jié)果表明，在同等飼喂條件下，生物發(fā)酵飼料的效果優(yōu)于青貯飼料，而青貯飼料優(yōu)于氨化飼料（蔡興旺等，2003）。Omafuvbe等（2004）發(fā)現(xiàn)，生物飼料在發(fā)酵過程可形成大量乳酸，使飼料有酸香的味道，刺激豬的食欲，進(jìn)而提高采食量。王連生等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌飼料可有效降低仔豬大腸桿菌的數(shù)量，降低腹瀉率。林標(biāo)聲等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，與不食用生物飼料的仔豬相比，食用生物飼料的仔豬平均日體重增長5.61%，飼料成本減少3.53%。

由以上研究可以發(fā)現(xiàn)，通過微生物作用生產(chǎn)生物飼料，使玉米深加工副產(chǎn)物得到合理利用，不僅可以提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，而且可以減少環(huán)境污染，保障食品安全。

1　材料與方法

1.1材料與儀器菌種：地衣芽孢桿菌BL13、地衣芽孢桿菌BL20、地衣芽孢桿菌BL53、地衣芽孢桿菌BL47、地衣芽孢桿菌BL49、戊糖片球菌（10）-1由中糧健康營養(yǎng)研究院提供；枯草芽孢桿菌AN 由中糧生物化學(xué)（安徽）股份有限公司提供；枯草芽孢桿菌GY 由青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司提供；標(biāo)準(zhǔn)枯草芽孢桿菌10089、標(biāo)準(zhǔn)枯草芽孢桿菌10090 由國家微生物菌種保藏中心提供；釀酒酵母由安琪股份有限公司提供。

材料：谷氨酸渣、廢液蛋白、糖渣、玉米漿、噴漿玉米皮、噴漿胚芽粕、糖蜜由公司自行提供。

儀器：高效液相色譜儀1260 infinity 安捷倫科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272 上海安競實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；生物傳感分析儀SBA-40E 山東省科學(xué)院生物研究所；自動(dòng)纖維分析儀A20001 上海龍捷儀器設(shè)備有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌種的活化與培養(yǎng)將一定量釀酒酵母菌粉于YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃發(fā)酵24 h，活化傳代2次，在YPD固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，繼續(xù)活化。

將一定量枯草芽孢桿菌GY菌粉和枯草芽孢桿菌AN菌粉分別置于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃發(fā)酵24 h，活化傳代2次，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，繼續(xù)活化。

戊糖片球菌（10）-1于-80 ℃冰箱中冷凍保存，取出并以2%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃過夜培養(yǎng)，活化傳代2次。在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，繼續(xù)活化。

除釀酒酵母、枯草芽孢桿菌GY和枯草芽孢桿菌AN之外，其余菌種于-80 ℃冰箱取出，接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在適宜溫度下培養(yǎng)一段時(shí)間，活化傳代2次，在相應(yīng)固體培養(yǎng)基上劃線，適宜溫度下培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，繼續(xù)活化。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基綜合動(dòng)物對(duì)飼料營養(yǎng)的需求、原料產(chǎn)量、原料成本、成品水分含量及乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌生長條件，并結(jié)合公司對(duì)附近市場的調(diào)研結(jié)果等各方面的考慮，設(shè)計(jì)如下配方。

表1　生物飼料的配方組成 %

表2　試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.2.3接種量發(fā)酵飼料的總接種量為2%，具體3種菌的接種比例如表3，為了消除菌濃度不同對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生的影響，在接種前，將所有菌濃度調(diào)為一致。按表3接種后，28 ℃恒溫發(fā)酵4～6 d。

表3　配方中各菌的接種量

1.2.4菌落總數(shù)的測定酵母菌采用平板菌落計(jì)數(shù)法（周傳云，2006），乳酸菌和芽孢桿菌采用傾注平板法菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5理化指標(biāo)的測定

乙醇、總糖、總酸：樣品經(jīng)前處理后，采用高效液相色譜儀測定上述指標(biāo)。

水分：采用國標(biāo)方法GBT6435-2006測定樣品中的水分含量。

灰分：采用國標(biāo)方法GBT6438-2007測定樣品中的灰分含量。

酸度：采用國標(biāo)方法GBT12456-2008測定樣品的酸度。

葡萄糖和乳酸：取1 g樣品于離心管中，加入9 g蒸餾水，混勻，從離心管中取出1 mL稀釋液，再加入9 mL蒸餾水，混勻。取兩次稀釋后的稀釋液，過0.22 μm濾膜，取一定量的濾液，用生物傳感分析器測定樣品中的葡萄糖和乳酸含量。

粗蛋白質(zhì)：稱取0.5 g（精確度為0.0001g）樣品置于消化管中，加入6.00 g硫酸鉀和硫酸銅的混合物（K2SO4：CuSO4=97：3），再加入15 mL濃硫酸，240 ℃消化1.5 h。將消化液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶定容，加堿至顏色變?yōu)樯钏{(lán)色，400 ℃蒸餾，吸收液為2%硼酸溶液。蒸餾后，用0.05 mol/L硫酸滴定。

纖維：取1 g（精確度為0.0001g）樣品于三角瓶中，加入150 mL 0.13mol/L硫酸，使其沸騰30 min，用抽濾設(shè)備將其中液體除去，并用熱水反復(fù)洗滌5次，而后加入150 mL 0.23 mol/L氫氧化鉀溶液沸騰30 min，冷卻一段時(shí)間，用綠濾紙過濾，用丙酮洗滌3次，而后130 ℃干燥2 h，放入干燥器中冷卻20 min，繼續(xù)碳化20 min，500 ℃馬弗爐灰化至恒重。

1.3數(shù)據(jù)處理每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次，運(yùn)用Microsoft excel 2003和SPSS Statistics軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果

對(duì)照組未檢出3種微生物，故圖1未顯示，由圖1看出，乳酸菌含量較多的枯草芽孢桿菌GY3、地衣芽孢桿菌BL13和地芽孢桿菌BL20，酵母菌含量較多的是地衣芽孢桿菌BL47和地衣芽孢桿菌BL49，芽孢桿菌含量較多的是地衣芽孢桿菌BL20和地衣芽孢桿菌BL47。

圖1　生物飼料中3種微生物的菌落數(shù)

由圖2看出，試驗(yàn)組的水分變化幅度不大，大多在43%左右；地衣芽孢桿菌BL47實(shí)驗(yàn)組蛋白質(zhì)增長幅度較小外，其他實(shí)驗(yàn)組粗蛋白質(zhì)含量均有一定幅度的提高。

圖2　生物飼料中水分和粗蛋白質(zhì)的含量

由圖3看出，試驗(yàn)組的乙醇含量遠(yuǎn)高于對(duì)照組（P＜0.05），除了地衣芽孢桿菌BL20和地衣芽孢桿菌BL47試驗(yàn)組相對(duì)較少外，證明實(shí)驗(yàn)組中酵母菌生長旺盛；試驗(yàn)組的總糖含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組（P＜0.05），證明在該基質(zhì)中微生物大量生長；總酸方面，除了地衣芽孢桿菌BL47實(shí)驗(yàn)組相對(duì)較少外，大部分試驗(yàn)組與對(duì)照組相差并不顯著（P ＞ 0.05）。

圖3　生物飼料中乙醇、總糖和總酸含量

由圖4看出，灰分方面，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；酸度方面，除地衣芽孢桿菌BL47相對(duì)較低外，其他組與對(duì)照組相比均不顯著（P＞0.05）；葡萄糖方面，試驗(yàn)組低于對(duì)照組（P＜0.05），同樣反映出在生物飼料中有微生物大量生長。乳酸方面，與酸度呈現(xiàn)相似的規(guī)律。

圖4　生物飼料中灰分、酸度、葡萄糖和乳酸含量

由圖5看出，試驗(yàn)組粗纖維含量相比對(duì)照組也得到不同程度的下降，其中枯草芽孢桿菌AN、地衣芽孢桿菌BL49、地衣芽孢桿菌BL53和標(biāo)準(zhǔn)10090+10089試驗(yàn)驗(yàn)組粗纖維含量下降較顯著（P＜ 0.05）。

圖5　生物飼料中粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量

3　討論

在芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌計(jì)數(shù)過程中發(fā)現(xiàn)如下問題：

酵母菌采用傾注法菌落計(jì)數(shù)，并未發(fā)現(xiàn)平板有菌落，但采用涂布平板法菌落計(jì)數(shù)，有菌落生長，分析可能原因是酵母菌生長所需溫度在28 ℃左右，而采用傾注法時(shí)，為了不使培養(yǎng)基凝固，需在40 ℃左右傾注平板，故酵母菌可能因?yàn)榕囵B(yǎng)基溫度過高而失活。

芽孢采用傾注平板法計(jì)數(shù)，但需在凝固的培養(yǎng)基上倒一層薄薄的2%瓊脂，以防芽孢生長過于旺盛，影響計(jì)數(shù)。

MRS培養(yǎng)基中加入500 mg/kg那他霉素，YPD培養(yǎng)基中加入10 mg/kg青霉素和50 mg/kg鏈霉素抑制芽孢生長。

4　結(jié)論

綜合菌落數(shù)、發(fā)酵度、乳酸、蛋白質(zhì)、纖維含量等的結(jié)果選擇糖渣23%、噴漿玉米皮11%、胚芽粕42%、谷氨酸渣2%、糖蜜2%、水20%作為培養(yǎng)基，接種0.6%戊糖片球菌（10）-1、0.4%釀酒酵母，1.0%枯草芽孢桿菌GY或地衣芽孢桿菌BL 49或地衣芽孢桿菌BL 53，28 ℃恒溫發(fā)酵4～6 d。得出一種高乳酸、高蛋白、低纖維生物飼料，其中含有2.0%乳酸、20.7%粗蛋白質(zhì)、4.3%粗纖維、3.1%灰分、6.6 lg CFU/mL乳酸菌、7.5 lg CFU/mL酵母菌、7.0 lg CFU/mL芽孢桿菌。

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