棉油皂腳酸化油脂肪酸的分子蒸餾法優(yōu)化分離及其組分檢測

羅　蘭，陳紅莉，唐　輝*，張心躍，唐　萍

（1.新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆石河子 832002；2.新疆西部牧業(yè)股份有限公司,新疆石河子 832099）

棉油皂腳是在棉籽精煉過程中堿煉中和產(chǎn)物，皂腳的產(chǎn)出率約為棉油總產(chǎn)量的5%～10%。皂腳中的主要成分為脂肪酸鹽、磷脂、中性油、棉酚、水分及其他類脂物（趙紅濤等，2013）。棉油皂腳中脂肪酸可以根據(jù)需要進行加工制備，應(yīng)用于相關(guān)行業(yè)（王穎穎，2011），進一步延伸棉油加工產(chǎn)業(yè)鏈。由于從棉油皂腳中提取的酸化油成分復(fù)雜，所含棉酚對動物有生殖毒性（呂云峰，2010），采用一般的方法既不能將棉酚等有色雜質(zhì)有效脫除，也不能將脂肪酸有效分離。分子蒸餾法主要是一種針對易分解，沸點較高或者熱敏物質(zhì)的分離方法（吳瓊，2015；胡偉，2011；Batistella C B，2002；馬傳國，2001），不僅能脫除酸化油中的色素（包括棉酚）和鞣質(zhì)，同時能增加脂肪酸的飼用安全性。本文采用分子蒸餾法分離酸化油中的脂肪酸，得到皂腳脂肪酸精組分，可應(yīng)用于飼料化研究。根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果已知，棉油皂腳中主要含有硬脂酸、棕櫚酸和亞油酸3種脂肪（羅蘭，2017），因此，將脂肪酸甲酯衍生化進行GC檢測（劉丹，2011），以3種脂肪酸含量作為分離效果及目標(biāo)產(chǎn)物（皂腳精組分）的評價指標(biāo)。本文在制備酸化油基礎(chǔ)上，用分子蒸餾法分離酸化油中脂肪酸，建立脂肪酸、棉酚含量測定方法，并對其含量進行檢測，為后續(xù)皂腳飼料產(chǎn)業(yè)化奠定基礎(chǔ)。

1　儀器與試劑

VKL 70-5-WRS-T型分子蒸餾儀，Agilent 6890氣相色譜儀，Waters 2695高效液相色譜儀，ES 225 SM-DR分析天平（瑞士），TDL-40 B型離心機（上海安亭飛鴿）。

棉油皂腳（新疆石河子匯昌油脂廠，20161116）、亞油酸甲酯對照品、棕櫚酸甲酯對照品、硬脂酸甲酯對照品（純度≥ 98%，上海源葉生物科技有限公司）、苯丙酮和正己烷。

2　實驗方法與結(jié)果

2.1確定考察指標(biāo)棉油皂腳中主要含有亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸3種脂肪酸，將這3種脂肪酸的純度及得率綜合評分作為考察指標(biāo)。

2.2溶液的制備

2.2.1內(nèi)標(biāo)溶液的制備精密移取苯丙酮10 μL于10 mL 容量瓶中，用正己烷定容，配制成濃度為1.009 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.2對照品溶液的制備精密稱量對照品棕櫚酸甲酯25 mg，硬脂酸甲酯17.39 mg，亞油酸甲酯38 mg于1 mL容量瓶中，用正己烷定容，配制成棕櫚酸甲酯，硬脂酸甲酯，亞油酸甲酯濃度分別為25.00、17.39、38.00 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備取0.2000 g樣品于10 mL帶塞試管中，加入濃硫酸-甲醇（1：20）溶液2 mL，在60～70 ℃水浴中振蕩15 min，冷卻至室溫，加入蒸餾水3～4 mL，混合均勻后加入正己烷萃取，靜置分層，用無水硫酸鈉脫水后轉(zhuǎn)移正己烷層于10 mL容量瓶，精密加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，即可進行GC分析。

2.3色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗色譜柱：Agilent 6890N 19091J-413 HP 5%phenyl Methyl Siloxane（30.0 mm×320 μm×0.25 μm）。柱溫 ：恒溫210 ℃（保持20 min）；進樣口溫度：270 ℃；FID 檢測器溫度：290 ℃；流速：0.8 mL/min；分流比：5：1；載氣：N2；進樣量：2 μL。在上述色譜條件下，進樣分析。

圖1　混和對照品

圖2　經(jīng)分子蒸餾法優(yōu)化分離的脂肪酸精組分

2.4線性關(guān)系考察將混合對照品溶液稀釋0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 倍制成一系列濃度梯度混合對照品溶液。按照上述色譜條件進行GC分析。并以對照品溶液質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制3種脂肪酸甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程如下（表1）。

表1　線性回歸方程

2.5方法學(xué)考察

2.5.1精密度精密吸取對照品溶液1 mL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算各脂肪酸甲酯的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值，其RSD值分別為2.4%、2.6%、2.1%，表示儀器精密度良好。

2.5.2重復(fù)性取供試品6份，每份約0.2 g，精密稱量，按“2.2”項下供試品溶液制備方法操作，計算棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、亞油酸甲酯含量的RSD值分別為2.1%、2.0%、2.3%，表示該方法重復(fù)性良好。

2.5.3穩(wěn)定性取供試品6份，每份約0.2 g，精密稱量，在室溫下放置 2、4、6、8、10、12 h 后測定，計算棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、亞油酸甲酯含量的RSD值分別為2.0%、2.3%、2.1%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4加樣回收率精密稱量9份樣品，分別加入80%、100%、120%3種不同濃度的對照品，按“2.2”項下供試品溶液制備方法操作進行測定，計算平均回收率，棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、亞油酸甲酯RSD值分別為2.6%、2.5%、2.2%。

2.6酸化油的制備將皂腳加水分散，加入1/10濃硫酸調(diào)節(jié) pH 至 2～ 3，水浴（85 ℃）1.5 h，用熱水洗至中性，分液離心得到上、中、下3層，分別是酸化油、鞣質(zhì)、水。具體工藝如圖3所示。

圖3　酸化油制備工藝流程

2.7分子蒸餾單因素考察與結(jié)果

2.7.1蒸餾溫度對分離效果的影響稱取50 g酸化油加入到分子蒸餾儀中，設(shè)置壓力為30 Pa，刮膜轉(zhuǎn)速為340 r/min，反應(yīng)溫度分別為100、125、150、160、175、180、190 ℃。以液氮為深冷劑，當(dāng)反應(yīng)條件達到設(shè)定要求時開始進料，調(diào)節(jié)進料速率，待反應(yīng)穩(wěn)定后，收集精組分進行GC含量檢測。2.7.2壓力對分離效果的影響稱取50 g酸化油加入到分子蒸餾儀中，壓力分別設(shè)置為10、30、50、70、90 Pa，進料溫度為 180 ℃，刮膜轉(zhuǎn)速為340 r/min。以液氮為深冷劑，當(dāng)反應(yīng)條件達到設(shè)定要求時開始進料，調(diào)節(jié)進料速率，待反應(yīng)穩(wěn)定后，收集精組分進行GC含量檢測。

2.7.3刮膜轉(zhuǎn)速對分離效果的影響稱取50 g酸化油加入到分子蒸餾儀中，刮膜轉(zhuǎn)速分別設(shè)定為 260、280、300、320、340 r/min，進料溫度為 180℃，壓力為30 Pa。以液氮為深冷劑，當(dāng)反應(yīng)條件達到設(shè)定要求時開始進料，調(diào)節(jié)進料速率，待反應(yīng)穩(wěn)定后，收集精組分進行GC含量檢測。

2.7.4單因素實驗結(jié)果由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著操作壓力的提高，精組分中脂肪酸純度先升高后降低，收率呈下降趨勢，這是因為當(dāng)操作壓力太小時，分餾出的精組分中雜質(zhì)較多，脂肪酸比例降低，由于壓力與溫度的關(guān)系，當(dāng)操作壓力變大時，蒸餾溫度也相應(yīng)提高，未達到脂肪酸蒸餾要求，導(dǎo)致純度與得率均有所下降；隨著蒸餾溫度的提高，純度和得率均有所增加，但當(dāng)溫度升高到190 ℃，脂肪酸純度降低，原因可能是蒸餾溫度過高雜質(zhì)也被蒸餾出；脂肪酸純度與得率隨轉(zhuǎn)速的增加而增加，刮膜器轉(zhuǎn)速太慢，加熱壁面上不易形成均勻的液膜，轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速太快會導(dǎo)致部分原料被甩到冷凝器上，所以會降低分離效率。

圖4　壓力、蒸發(fā)溫度、刮膜轉(zhuǎn)速對脂肪酸純度和得率影響

2.8分子蒸餾法的正交實驗優(yōu)化與結(jié)果取50 g的酸化油3份，每份平行取3個樣，根據(jù)單因素實驗結(jié)果設(shè)定選取正交實驗考察因素：蒸餾溫度170、180、190 ℃，壓力 30、 50、70 Pa，刮膜速率260、300、340 r/min，見表 3。

表3　正交因素水平

根據(jù)相關(guān)參考文獻以及實驗經(jīng)驗，對純度、得率兩個指標(biāo)綜合評分。分別取兩個權(quán)重系數(shù)為ω1=0.6和ω2=0.4。綜合評分=ω1* 純度指標(biāo) +ω2* 得率指標(biāo)。純度指標(biāo)為所檢測的3種脂肪酸總重量與分子蒸餾出的精組分的比值。得率指標(biāo)為精組分重量與酸化油重量的比值。

由表4可得：根據(jù)極差可知，影響因素的順序為A＞B＞C，在正交實驗中對實驗結(jié)果影響最大的是A蒸發(fā)壓力，其次是B蒸發(fā)溫度，影響最小的C刮膜轉(zhuǎn)速。因此，本實驗理論最佳實驗條件為A3B2C1。

由表5可知，A、B兩個因子對實驗結(jié)果均呈顯著影響，即實驗所選的蒸發(fā)壓力、蒸發(fā)溫度對實驗結(jié)果產(chǎn)生顯著影響，其中蒸發(fā)壓力對實驗結(jié)果的影響最大。而C因子對實驗結(jié)果無顯著影響。本實驗選擇的最佳條件應(yīng)：A3B2C1，即蒸發(fā)壓力：30 Pa，蒸發(fā)溫度 ：180 ℃，刮膜速率 ：340 r/min。

2.9最佳實驗條件的驗證在最佳分子蒸餾條件下，純度與得率綜合評分達75.22，驗證實驗表明，該優(yōu)化工藝可取，故確定該條件為最佳工藝。

2.10皂腳脂肪酸精組分的檢測

2.10.1脂肪酸含量測定由表6可知，精組分純度平均值83.1%，得率平均值63.4%，綜合評分75.22。2.10.2游離棉酚測定通過HPLC法對棉酚進行分析檢測，如圖5所示。

表4　L9（34）正交試驗結(jié)果

表5　方差分析

表6　皂腳精組分脂肪酸含量

圖5　HPLC法測定游離棉酚

（1）對照品溶液的制備：精密稱取棉酚對照品12.50 mg，置25 mL量瓶中，用乙腈定容，再精密吸取5～25 mL量瓶中，乙腈定容，搖勻即得。

（2）供試品溶液的制備：精密稱取精組分10 g置錐形瓶中，以50 mL丙酮（HcL調(diào)節(jié)pH=2）溶解，45 ℃攪拌1 h后移至離心管中（3000 r/min，15 min）離心，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶，丙酮定容，移取2～10 mL量瓶，乙腈稀釋至刻度，再移取1～10 mL量瓶，乙腈定容，搖勻即得。

（3）色譜條件：色譜柱Waters TccQ·Tag Amino Acid Analysis C 18 Column（3.9 mm×150 mm，4 μm）；流動相：乙腈：0.7%磷酸水=80：20；檢測波長：238 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量 ：10 μL。

由圖5可知：皂腳精組分中未檢測出棉酚，經(jīng)分子蒸餾可脫出酸化油中的棉酚，確保安全。

3　結(jié)論

酸化油中含有豐富的脂肪酸，采用分子蒸餾技術(shù)實現(xiàn)脂肪酸與雜質(zhì)有效分離。選取操作壓力、蒸發(fā)溫度和刮膜速率3個主要影響因素作為考察對象，進行單因素考察及正交設(shè)計實驗，確定反應(yīng)條件為蒸發(fā)壓力：30 Pa，蒸發(fā)溫度：180 ℃，刮膜速率：340 r/min時分離效果最優(yōu)，脂肪酸純度達83.1%，得率達63.4%。通過本實驗實現(xiàn)了棉油皂腳中脂肪酸的優(yōu)化分離，提高了脂肪酸的純度，增強安全性，擴大了應(yīng)用范圍，為后續(xù)棉油皂腳飼料化的研究提供依據(jù)。

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