玉米中嘔吐毒素的表面等離子諧振生物傳感器檢測技術(shù)研究

周歷嵐，米佳飛，王戰(zhàn)輝*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 100193；2.中糧肉食投資有限公司,北京 100020）

嘔吐毒素（Deoxynivalenol，DON）又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，是由E鐮刀菌屬、木霉菌、禾谷鐮刀菌等多種真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，屬單端孢霉烯族化合物。1973年DON結(jié)構(gòu)被闡明（Scarpino等，2015；Yoshizawa等，1973）。其化學(xué)名稱為 3α，7α，15-三羥基 -12，13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮，是四環(huán)的倍半萜（Krska等，2001）。DON在甲醇溶劑中不穩(wěn)定，室溫放置22 d后其TLC發(fā)生明顯變化，乙腈和乙酸乙酯可做為 DON的長期保存溶劑（Wei等，1986）。DON熱穩(wěn)定性強，對堿性較敏感，經(jīng)加堿、高壓、熱蒸汽的處理后可除掉部分毒素（Cenkowski等，2006），延長時間可以去掉全部毒素。不同種類動物對DON的敏感性不同，豬對DON最敏感，在攝入1mg/kg DON后會引起拒食。禽類、反芻動物對DON非常不敏感（Philippe等，2008）。Sypecka等（2004）發(fā)現(xiàn)，DON對雞蛋不造成影響，即使飼料中DON含量高達10 mg/kg，蛋中DON含量依然很低，產(chǎn)蛋量也并未受到影響。

DON是飼料中對畜禽危害最大的真菌毒素之一，可引起畜禽真菌毒素中毒癥。因此，檢測飼料中DON殘留量十分必要。目前，真菌毒素檢測方法很多，但都不同程度地存在樣品前處理復(fù)雜、操作時間長等缺點，因此，探索快速準確的真菌毒素檢測方法是當前的研究熱點?；诒砻娴入x子諧振（Surface plasmon resonance，SPR）原理開發(fā)的傳感器利用生物薄膜技術(shù)，把具有特異性生物表面基質(zhì)的目標物印刷在金屬膜表面，并且利用生物偶聯(lián)等方法在基質(zhì)層上進行修飾特定蛋白，實現(xiàn)對溶液中目標物的檢測。該技術(shù)具有操作簡單、耗樣量少、檢測時間短、無需標記、靈敏度高，能實時監(jiān)測反應(yīng)動態(tài)過程，無需純化各種生物組分，只需對樣品進行簡單處理的優(yōu)點，已被應(yīng)用于化學(xué)性危害物的檢測領(lǐng)域。然而針對真菌毒素的SPR檢測方法報道較少，因此，本研究利用SPR技術(shù)制備了傳感器芯片，建立DON的SPR檢測方法，為快速高通量檢測玉米中DON殘留提供了新的思路。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑表面等離子諧振儀Interbio S400（北京華安麥科生物技術(shù)有限公司）；NanoDrop1000蛋白核酸微定量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher公司）；DZX-3真空干燥箱（上海?，斣O(shè)備有限公司）；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；超凈工作臺（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-200KD超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FBS210S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

牛血清白蛋白（BSA）；卵清蛋白（OVA）；嘔吐毒素（DON）；聚乙二醇（PEG，MW4000）；1，1-羰基二咪唑（CDI）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC.HCL）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）；二甲基甲酰胺（DMF）；MES購自Sigma公司；羧基修飾的SPR芯片IB-CM來源于北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1嘔吐毒素包被原制備將DON與卵清蛋白（OVA）共價偶聯(lián)，得到DON的包被原（DONOVA）。具體方法如下：稱取5 mg DON標準品，并溶解于1 mL色譜級乙腈中得到DON母液。稱8.8 mg 1，1-羰基二咪唑（CDI）加入到 200 μL DON母液中，充分混勻并常溫避光反應(yīng)1 h。稱取30 mg OVA，充分溶解于500 μL的偶聯(lián)緩沖液。

1.2.2羧基芯片表面活化將羧基修飾的SPR芯片IB-CM安裝到SPR上，用PBS緩沖液，流速10 mL/min，沖洗芯片表面至基線平穩(wěn)。再用MES緩沖液，流速10 mL/min，沖洗至基線平穩(wěn)。取50 mmol/L NHS和200mmol/L EDC、HCL等體積混合，流速1 mL/min，均勻流過芯片表面，活化10 min。

1.2.3抗體結(jié)合濃度優(yōu)化根據(jù)芯片載量確定結(jié)果，確定0.2 mg/mL的DON-OVA為合適包被濃度。選擇不同的DON單克隆抗體，流速為5 μL/mL，從100 μg/L開始，10倍稀釋3個梯度反應(yīng)20 min。根據(jù)抗原抗體結(jié)合曲線，確定合適的抗體濃度區(qū)間。

1.2.4反應(yīng)時間對DON檢測的影響為確定反應(yīng)時間對SPR檢測DON的影響，設(shè)計3組處理方式：

處理1：DON標準品與抗體混合物直接流過合成抗原DON-OVA包被的SPR芯片，不做停留。流速為5 μL/min。處理2：DON標準品與抗體混合物流過合成抗原DON-OVA包被的SPR芯片時孵育30 min。進樣流速為5 μL/min。處理3：DON標準品與抗體混合物流過合成抗原DONOVA包被的SPR芯片時孵育60 min，進樣流速為5 μL/min。每種處理重復(fù)3次，根據(jù)檢測的標準差及反應(yīng)曲線判定反應(yīng)時間對DON檢測的影響。

1.2.5標準曲線的建立和檢測限的確定根據(jù)上述實驗確定的抗原、抗體工作濃度和反應(yīng)時間建立SPR標準曲線，操作如下：將DON-OVA抗原用pH 3.6的乙酸鹽緩沖液稀釋到終濃度為0.2 mg/mL，包被芯片，流速 2 μL/mL，反應(yīng) 30 min。將芯片用PBST洗液洗滌，流速10 mL/min，洗滌10 min。將芯片用1 M的乙醇胺封閉，流速2 μL/mL，反應(yīng)30 min。將倍比稀釋的DON標準品與DON抗體混合后加入芯片中，5 μL/mL流速。根據(jù)檢測值建立標準曲線和檢測限。

1.3玉米樣本中嘔吐毒素檢測

1.3.1玉米樣本的處理取自然污染DON的玉米樣本，參考GB/T 14699.1采樣，按GB/T 20195使用四分法將樣品縮減至500 g，全粉碎后過1 mm的分析篩，充分混勻后裝入真空袋內(nèi)備用（若放置超24 h需放置在4 ℃冷藏柜中保存）。稱取5 g玉米粉，加入25 mL 60%甲醇溶液，震蕩混勻20 min，提取后的樣本用快速定性濾紙過濾，濾液加入10倍體積的PBS緩沖液稀釋。稀釋液用0.22 μm的濾膜過濾，過濾后用SPR儀檢測。取200 μL稀釋后的提取液加入等體積的DON抗體，混合均勻后注入SPR儀檢測，5 μL/mL流速，記錄檢測結(jié)果。

1.3.2用于HPLC檢測的玉米樣本處理稱取玉米樣本5 g，并過1 mm分樣篩，加入5 g聚乙二醇，125 mL蒸餾水；劇烈振蕩加入提取液后的樣本20 min。用快速定性濾紙過濾，收集濾液；濾液再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液，取2.5 mL上樣液過免疫親和柱凈化。將DON免疫親和柱在室溫平衡30 min，上述提取液取2.5 mL流過免疫親和柱，待液體排干后，將親和柱用離子水洗滌2次，每次10 mL。待液體排干后，上樣1 mL甲醇，流速1滴/s，收集洗脫液并在50～60℃加熱條件下氮氣吹干，然后用1 mL流動相復(fù)溶。復(fù)溶液用0.22 μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶中用于HPLC儀器分析。色譜柱：C18柱 ；流動相 ：V（甲醇）：V（水）＝ 20：80；流速 ：1 mL/min；柱溫：40℃；紫外檢測波長：218 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1DON單克隆抗體濃度優(yōu)化選擇不同濃度稀釋的DON單克隆抗體與DON-OVA包被抗原相結(jié)合。根據(jù)結(jié)合曲線選擇合適的抗體稀釋濃度，結(jié)果見圖2。

圖2　SPR檢測DON抗體濃度優(yōu)化

從上圖可以看出，抗體濃度越高，曲線上升越快，最終的SPR值更高。表明抗體濃度高時，抗原抗體反應(yīng)速度更快。在抗體濃度為10 μg/L和1 μg/L組可以看出，兩個濃度的抗體最終結(jié)合后的SPR值相同，但10 μg/L的DON抗體結(jié)合速度更快，更容易達到峰值。根據(jù)抗體結(jié)合速率、結(jié)合后的SPR值及抗體的成本，最終選擇10 μg/L的抗體濃度作為合適的反應(yīng)濃度。

2.2競爭反應(yīng)時間對DON檢測的影響主要考察標品與抗體混合液及芯片上的包被抗原的作用時間是否會影響到DON的檢測效果。設(shè)計不同的反應(yīng)時間，比較反應(yīng)曲線變化及檢測結(jié)果的變異來評估其對DON檢測的影響，結(jié)果見圖3。

從檢測結(jié)果可以看出，當孵育時間為0時，即標準品與抗體的混合液直接流過DON-OVA包被的芯片，不同檢測次數(shù)間的偏差較大，檢測曲線的線性較差。隨著孵育時間延長，不同檢測次數(shù)間數(shù)據(jù)變異變小，檢測曲線的線性較好。孵育時間為30 min時的靈敏度優(yōu)于60 min。綜合檢測的線性區(qū)間與方法靈敏度兩個因素，選擇了孵育30 min作為合適的反應(yīng)時間。

圖3　不同孵育時間對DON檢測的影響

2.3SPR檢測DON的線性區(qū)間與檢測限根據(jù)上述實驗結(jié)果，選擇10 μg/L的DON單克隆抗體濃度，選擇0.5～100 μg/L的DON標準品濃度。取200 μL標準品與等體積的DON單克隆抗體混合后，以5 μL/min注入包被有DON-OVA的SPR芯片中，并孵育30 min。根據(jù)SPR信號值與標準品濃度繪制標準曲線，并計算回歸方程，結(jié)果如圖4，計算得出該SPR檢測方法的線性范圍為0.5～100 μg/L，方法檢測限為0.5 μg/L。

曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.9848，回歸方程為Y=-156lnx+990.95

圖4　SPR檢測嘔吐毒素的標準曲線

2.4玉米樣本檢測結(jié)果

2.4.1方法檢測限的確定檢測限由20份空白玉米樣品測得的平均值加上3倍的標準差計算而得，由表1計算得到該方法的檢測限為96.22 μg/kg。

表1　檢出限測定結(jié)果統(tǒng)計表 g/kg

2.4.2玉米中嘔吐毒素DON添加回收率的測定100、300 μg/kg和 900 μg/kg 3個 濃 度 的 DON添加空白玉米中時，所得到的檢測結(jié)果見表2，從表中可知回收率為81.8%～111.2%，變異系數(shù)均小于15%。

表2　玉米中嘔吐毒素添加回收率的測定 %

2.4.3實際樣本檢測選擇DON自然污染的玉米樣本，經(jīng)過樣本前處理，用SPR方法檢測。同時用HPLC檢測作為對比，檢測結(jié)果見表3。從表中可看出，SPR方法檢測DON的結(jié)果與標準的HPLC方法相關(guān)性良好，R2為0.9581。

表3　玉米樣本中嘔吐毒素含量檢測結(jié)果

3　討論

圖5　玉米樣品HPLC與SPR相關(guān)性分析

Kadoka等（2010）將SPR應(yīng)用于檢測小麥中雪腐鐮刀菌醇和DON。Van等（2003）將霉菌毒素用羧甲氧胺半鹽酸鹽羧基化實現(xiàn)SPR檢測。Daly等（2000）第一次將SPR技術(shù)應(yīng)用到AFB1的檢測。本研究建立了基于SPR技術(shù)的玉米中DON殘留的免疫檢測分析方法，實現(xiàn)了對玉米中DON的快速非標記檢測。為提高檢測靈敏度，分別從抗體濃度、反應(yīng)時間等方面對SPR方法進行優(yōu)化。選擇3種不同濃度的DON單抗，采用10倍梯度稀釋單抗。根據(jù)SPR反應(yīng)曲線可知，DON單抗在高濃度時（100 μg/L），反應(yīng)曲線上升很快，結(jié)合后的信號值較高，說明抗體與SPR芯片上的包被抗原結(jié)合速率很高，抗原抗體最終的結(jié)合量也更高。在抗體濃度降低時，結(jié)合曲線變得相對更平滑，說明結(jié)合速率下降；同時SPR曲線的峰值也在下降，說明最終的抗體結(jié)合量下降。在結(jié)合曲線上可以看出，抗體在10 μg/L與1 μg/L時，結(jié)合速率有較大差別，但最終的結(jié)合量卻相同。根據(jù)抗原抗體結(jié)合速率、成本考慮，選擇1μg/L的DON抗體作為合適的抗體工作濃度。

為比較競爭反應(yīng)時間與檢測結(jié)果的關(guān)系。選擇3種不同的反應(yīng)時間（孵育時間），0 min，30 min和60 min。結(jié)果表明，孵育時間主要影響檢測結(jié)果變異，孵育時間越長，標準差越小。同時，孵育時間也會影響方法的線性范圍與靈敏度?？傮w來說，孵育時間越長，線性區(qū)間越寬，線性較好。但孵育時間越長，完成檢測的時間就更長。綜合考慮檢測時間、線性范圍與靈敏度等因素，選擇孵育30 min作為最終的孵育時間。

4　結(jié)論

本研究建立了玉米中DON的SPR檢測分析方法。通過優(yōu)化確定抗體工作濃度為10 μg/kg、確定最適反應(yīng)時間為30 min。方法檢測限為96.22 μg/kg，回收率為81.8%～111.2%，變異系數(shù)小于15%。經(jīng)玉米實際樣本測試，SPR檢測方法與HPLC方法的相關(guān)性良好，R2均大于0.95。

[1]Daly SJ. Development of surface plasmon resonance-based immunoassay for aflatoxin B1[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2000，48（11）：5097～ 5104.

[2]Cenkowski S，Pronyk C，Abramson D. Superheated steam reduction of deoxynivalenol in naturally contaminated wheat kernels[J]. Food Control，2006，17（10）：789 ～ 796.

[3]Kadota T，Takezawa Y，Hirano S，et al. Rapid deletion of nivalenol and deoxynivalenol in wheat using surface plasmon resonance immunoassay [J]. Analytica Chimica Acta，2010，673（2）：173～ 178.

[4]Krska R，Baumgartner S，Josephs R. The state-of-the-art in the analysis of type-A and-B trichothecene mycotoxins in cereals[J]. Fresenius' Journal of Analytical Chemistry，2001，371（3）：285～299.

[5]Philippe P，F(xiàn)rancesc A，Erwan B，et al. Ingestion of deoxynivalenol（DON）contaminated feed alters the pig vaccinal immune responses [J]. Toxicology Letters，2008，177（3）：215～222.

[6]Scarpino V，Reyneri A，VanaraF，et al. Relationship between European Corn Borer injury，F(xiàn)usarium proliferatum and F.subglutinans infection and moniliformin contamination in maize [J].Field CropsResearch，2015，183：69～ 78.

[7]Sypecka Z，Kelly M，Brereton P. Deoxynivalenol and zearalenone residues in eggs of laying hens fed with a naturally contaminated diet：Effects on egg production and estimation of transmission rates from feed to eggs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52（17）：5463～ 5471.

[8]Van DGB，Spath S，Dietrich H，et al. Biosensors and multiple mycotoxin analysis [J]. Food Control，2003，14（4）：251 ～ 254.

[9]Wei RD，Chu FS. Instability of some trichothecenes in methanol[J]. Journal-Association of Official Analytical Chemists，1986，69（5）：902～903.

[10]Yoshizawa T，Morooka N. Deoxynivalenol and its monoacetate：new mycotoxins from Fusarium roseum and moldy barley [J]. Agricultural and Biological Chemistry，1973，37（12）：2933～2934.