玉米大斑病廣譜抗性外引自交系的發(fā)掘與抗病基因初步鑒定

肖明綱　 宋鳳景　 孫　兵　 左　辛　 趙廣山　 辛愛(ài)華　 李柱剛,*

1黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站, 黑龍江哈爾濱 150086; 2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所/黑龍江省寒地作物生理生態(tài)實(shí)驗(yàn)室/黑龍江省作物分子設(shè)計(jì)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黑龍江哈爾濱 150086; 3青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 山東青島 266109; 4黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)村能源研究所, 黑龍江哈爾濱 150086; 5佳木斯市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站, 黑龍江佳木斯 154002

玉米大斑病(northern corn leaf blight, NCLB)是由大斑凸臍蠕孢(Exserohlium turcicumPass. Leonard et Suggs)侵染引致的玉米生產(chǎn)中一種重要的葉部病害, 在我國(guó)主要分布于東北地區(qū)、華北北部和西南地區(qū)等氣候較涼爽的玉米種植區(qū), 常造成大面積減產(chǎn)[1]。20世紀(jì) 80年代, 由于感病雜交種的淘汰, 有效遏制了大斑病在我國(guó)的大范圍流行[2-3]。20世紀(jì)90年代, 因抗病雜交種的大面積推廣種植, 病原菌產(chǎn)生了新的生理小種, 大斑病危害再次升級(jí)[4]。2002年以來(lái), 大斑病危害呈回升趨勢(shì), 2003—2006年在東北春玉米區(qū)大斑病大范圍嚴(yán)重發(fā)生, 對(duì)生產(chǎn)造成較大影響[5]。因氣候條件適宜, 病原菌致病力分化, 感病品種及其相似品種的大面積種植, 2012—2017年玉米大斑病連續(xù)重度發(fā)生, 對(duì)玉米生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。

迄今, 已報(bào)道的玉米抗大斑病主效基因有 10個(gè), 被分別定位在第1、第2、第3、第7和第8染色體上, 其中Ht1、Ht2、Ht3、HtN、HtM、HtP、NNc和St為顯性單基因,ht4和rt為隱性基因[6-12]。Ht1基因已經(jīng)廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外的育成品種中, 在20世紀(jì)80年代, 我國(guó)利用抗大斑病自交系Mo17為親本選育出一批抗病雜交種, 有效遏制了大斑病在我國(guó)的大范圍流行。

在我國(guó)東北地區(qū)、華北北部和西南等玉米種植區(qū), 涼爽的氣候條件利于玉米大斑病流行爆發(fā)而造成大面積減產(chǎn)[1-5]。培育和種植抗病品種是控制玉米病害、減少產(chǎn)量損失的有效途徑, 而優(yōu)異的抗性資源則是進(jìn)行玉米抗病育種的基礎(chǔ)。目前玉米大斑病在我國(guó)各玉米區(qū)發(fā)生越來(lái)越普遍, 危害也越來(lái)越嚴(yán)重, 針對(duì)這種情況, 我們利用人工接種方法, 對(duì)引自美國(guó)、德國(guó)、法國(guó)和俄羅斯的 43份玉米種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定和評(píng)價(jià), 篩選抗性資源, 探究其真實(shí)抗性水平, 為我國(guó)玉米抗大斑病育種提供基礎(chǔ)材料和抗性信息; 利用 F2群體對(duì)高抗大斑病材料進(jìn)行了初步的抗性遺傳分析, 利用生產(chǎn)上的優(yōu)勢(shì)小種和強(qiáng)致病力小種進(jìn)行了抗譜分析, 為進(jìn)一步定位和利用其抗大斑病基因奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　供試自交系

43份外引自交系, 其中美國(guó)30份、法國(guó)6份、俄羅斯4份、德國(guó)3份; 自交系Mo17 (MR)和獲白(HS)為抗感對(duì)照。

1.2　供試病原菌

大斑凸臍蠕孢(Exserohilum turcicum), 分離自黑龍江省玉米發(fā)病葉片。

1.3　抗病鑒定圃設(shè)置

玉米大斑病抗性鑒定圃設(shè)置在位于哈爾濱市民主鄉(xiāng)的黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所實(shí)驗(yàn)基地。每份材料種植2行, 行長(zhǎng)5 m, 行距0.65 m, 每行留苗25～30株,株距略小于大田生產(chǎn), 田間正常管理。2015年和2016年對(duì) 2014年鑒定得到的抗病材料進(jìn)行重復(fù)鑒定, 以探究其真實(shí)抗性。

1.4　人工接種及抗性評(píng)價(jià)

1.4.1玉米大斑病接種方法將菌種接種于經(jīng)高壓滅菌的高粱粒上, 在23～25℃黑暗條件下培養(yǎng)至菌絲布滿高粱粒, 用水洗去高粱粒表面菌絲體, 攤鋪于潔凈瓷盤中,保持高濕度, 在室溫和黑暗條件下培養(yǎng)。鏡檢確認(rèn)大量產(chǎn)生分生孢子后, 直接用水淘洗高粱粒, 配制接種懸浮液。待玉米展 13葉期時(shí)利用孢子懸浮液噴霧接種, 乳熟后期調(diào)查[1]。

1.4.2玉米大斑病抗性評(píng)價(jià)調(diào)查每份鑒定材料群體的發(fā)病狀況, 調(diào)查重點(diǎn)部位為玉米果穗的上方葉片和下方3葉。病斑占葉面積少于或等于5%為1級(jí)(HR), 占葉面積6%～10%為3級(jí)(R), 占葉面積11%～30%為5級(jí)(MR),占葉面積31%～70%為7級(jí)(S), 全株葉片基本為病斑覆蓋,葉片枯死為9級(jí)(HS)[1]。

1.5　高抗材料大斑病抗性遺傳初步分析

用7份高抗外引材料分別與感病自交系獲白雜交, 產(chǎn)生F2分離群體, 在玉米13葉期時(shí)人工接種相應(yīng)的F2群體和感病對(duì)照獲白, 乳熟后期調(diào)查每個(gè) F2植株玉米果穗的上方葉片和下方3葉的總體發(fā)病狀況[1]。計(jì)算各群體抗、感個(gè)體的分離比例, 用 SAS 8.2軟件(SAS Institute, Raleigh, NC, USA) 計(jì)算分離比例的χ2值和概率值, 進(jìn)行分離比例的適合性測(cè)驗(yàn)。

1.6　高抗材料抗譜分析

1.6.1幼苗的準(zhǔn)備種子經(jīng)2%的次氯酸鈉表面消毒處理后, 在 25℃下催芽 3～4 d。待萌動(dòng)后, 分別播于 10 cm×10 cm 的花盆內(nèi), 每盆播種 4粒, 出苗后每盆保苗 3株[13]。

1.6.2接種液制備將生理小種0、1、2、N、123N純培養(yǎng)接種到高粱粒培養(yǎng)基上擴(kuò)繁, 待產(chǎn)生分生孢子后用純凈水沖洗制成孢子懸浮液, 孢子濃度 1×105～1×106個(gè)mL-1, 滴加0.1%吐溫振蕩搖勻即可用于接種[13]。

1.6.3人工噴霧接種待幼苗長(zhǎng)至 8～10葉期時(shí)進(jìn)行噴霧接種。接種后保濕 24 h, 然后溫室進(jìn)行正常管理, 室內(nèi)溫度控制在25℃左右。接種2周后進(jìn)行發(fā)病調(diào)查[13]。

1.6.4病斑調(diào)查R型： 條狀萎蔫褪綠斑或褐色窄條形的壞死斑, 有時(shí)有黃色暈圈, 不產(chǎn)生或很少產(chǎn)生孢子;S型： 梭狀大型斑, 中間明顯壞死, 病斑周圍有明顯的萎蔫中毒區(qū), 條件適宜時(shí)產(chǎn)生大量褐色霉層[13]。

2　結(jié)果與分析

2.1　引進(jìn)材料對(duì)玉米大斑病抗性評(píng)價(jià)

2014年利用孢子懸浮液噴霧接種法對(duì)43份外引自交系進(jìn)行了抗大斑病人工接種鑒定, 感病對(duì)照獲白病斑占葉片總面積的比率為90%, 而抗病對(duì)照Mo17病斑占葉片總面積的比率為15%, 抗感對(duì)照抗病性差異顯著, 能夠有效區(qū)分待鑒定材料的真實(shí)抗性, 表明人工接種鑒定結(jié)果有效。2014年, 從43份鑒定資源中共篩選到高抗材料7份, 抗病材料 1份, 中抗材料 6份, 高感材料 7份, 感病材料22份(圖1)。

從上述鑒定結(jié)果可以看出, 引進(jìn)的43份國(guó)外資源, 在大斑病抗性方面具有廣泛的變異, 來(lái)源于美國(guó)的自交系A(chǔ)04高抗大斑病, 來(lái)源于德國(guó)的自交系 G03高感大斑病(圖2), 其中的抗性材料對(duì)豐富我國(guó)玉米抗大斑病種質(zhì)資源、拓寬其遺傳基礎(chǔ)具有重要利用價(jià)值。

圖1　外引材料2014年大斑病抗性級(jí)別分布Fig. 1　Distribution of northern corn leaf blight resistance score for foreign maize inbred lines in 2014HR： 高抗; R： 抗; MR： 中抗; S： 感; HS： 高感。HR： highly resistant; R： resistant; MR： moderately resistant;S： susceptible; HS： highly susceptible.

圖2　外引材料高抗和高感大斑病田間表型Fig. 2　Field phenotype of foreign maize inbred lines highly resistant and highly sensitive to northern corn leaf blightA04、G03： 自交系; HR： 高抗; HS： 高感。A04, G03： inbred lines; HR： highly resistant; HS： highly susceptible.

2.2　外引材料抗玉米大斑病重復(fù)鑒定

2015年和2016年對(duì)14份抗大斑病材料, 又進(jìn)行了連續(xù)2年的重復(fù)鑒定, 感病對(duì)照獲白病斑占葉片總面積的比率分別為90%和95%, 抗病對(duì)照Mo17病斑占葉片總面積的比率分別為25%和20%, 抗感對(duì)照充分發(fā)病, 人工接種鑒定有效。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 這些材料年際間大斑病抗性表現(xiàn)穩(wěn)定, 反應(yīng)了其真實(shí)抗病性, 具體鑒定結(jié)果如表1所示。這些材料可作為重要的抗大斑病資源, 用于改善我國(guó)玉米抗大斑病種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)狹窄的現(xiàn)狀。

2.3　高抗大斑病材料抗性遺傳初步分析

7份供試自交系對(duì)大斑凸臍蠕孢的反應(yīng)型均表現(xiàn)為高抗, 而感病親本獲白則為高感。根據(jù)各供試材料與獲白配制的雜種F2植株對(duì)大斑凸臍蠕孢的反應(yīng)型, A04/獲白、F02/獲白、F05/獲白和 R01/獲白這些 F2群體抗、感植株比例都符合 3∶1的分離比, 而 A11/獲白、A24/獲白和G02/獲白的F2群體抗、感植株比例不符合3∶1的分離比(表2), 說(shuō)明A04、F02、F05和R01對(duì)大斑凸臍蠕孢的抗性可能受1對(duì)顯性單基因或少數(shù)主效基因控制。

2.4　高抗大斑病材料抗譜分析

遺傳分析表明, 自交系 A04、F02、F05和 R01對(duì)玉米大斑病的抗性均受1對(duì)顯性單基因控制。因此, 利用當(dāng)前優(yōu)勢(shì)小種0和1號(hào)、2號(hào)生理小種、N號(hào)生理小種及強(qiáng)致病力小種123N對(duì)A04、F02、F05和R01進(jìn)行了抗譜分析。生理小種0、1、2、N及123N對(duì)A04、F02、F05和 R01均無(wú)毒性, 而強(qiáng)致病力小種 123N對(duì)Ht1、Ht2、Ht3和HtN均有毒性, A04、F02、F05和R01對(duì)4個(gè)生理小種的反應(yīng)型均不同于Ht1、Ht2、Ht3和HtN的反應(yīng)型(表3)。說(shuō)明自交系 A04、F02、F05和 R01對(duì)大斑病的抗性不同于已定位的抗大斑病基因Ht1、Ht2、Ht3和HtN, 可能攜帶新的抗病基因。

表1　14份外引材料對(duì)玉米大斑病多年抗性鑒定Table 1　Identification of resistance to northern corn leaf blight of 14 foreign inbred lines across years

表2　7個(gè)F2群體對(duì)大斑凸臍蠕孢的抗性反應(yīng)Table 2　Reactions of seven F2 populations to Exserohilum turcicum of northern corn leaf blight

表3　4份玉米自交系對(duì)0、1、2、N和123N的反應(yīng)型Table 3　Infection types in the four foreign inbred lines to isolates 0, 1, 2, N, and 123N of northern corn leaf blight

3　討論

玉米對(duì)大斑病的抗性有兩種遺傳類型, 即質(zhì)量遺傳抗性和數(shù)量遺傳抗性, 這兩種抗性均廣泛應(yīng)用于玉米抗病育種中[11,14]。

質(zhì)量抗性, 也叫小種?；剐? 是受顯性單基因控制的垂直抗性。質(zhì)量抗性基因在控制玉米大斑病危害方面取得過(guò)顯著成效[15]。但長(zhǎng)期大面積種植同一抗源選育的品種, 由于病菌與寄主互作具有普遍的基因?qū)蜿P(guān)系, 很容易使有效的抗病基因隨著病菌對(duì)定向選擇壓力的適應(yīng)性變異而失去作用, 形成所謂的“抗性”喪失現(xiàn)象[5,15-16]。因此, 尋找更多、更有效、更易利用的抗病自交系或基因資源是當(dāng)前我國(guó)玉米抗病育種的一項(xiàng)十分緊迫的任務(wù)。

自交系A(chǔ)04株型清秀, 年際間抗性穩(wěn)定, 病斑面積占總?cè)~片面積的比率為 1%, 其最大特點(diǎn)是脫水快、適宜直收; F02和F05株高和穗位較低, 粒深軸細(xì), 產(chǎn)量高, 年際間病斑面積占葉片總面積的比率有波動(dòng), 最高分別為 3%和2%; R01抗低溫能力較強(qiáng), 年際間抗性穩(wěn)定, 病斑面積占葉片總面積的比率為4% (表1)。以病情級(jí)別為唯一標(biāo)準(zhǔn), 對(duì)A04、F02、F05和R01進(jìn)行抗性遺傳分析和多小種鑒定, 結(jié)果表明, A04、F02、F05和R01對(duì)大斑病的抗性受一對(duì)顯性單基因控制(表 2), 且可能攜帶有新基因(表 3)。對(duì) A04、F02、F05和 R01攜帶的抗病基因精細(xì)定位、克隆和功能驗(yàn)證, 以豐富我國(guó)玉米抗大斑病基因資源, 開(kāi)發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記, 利用分子標(biāo)記輔助選擇及回交轉(zhuǎn)育等手段, 提高我國(guó)當(dāng)前玉米生產(chǎn)上常用種質(zhì)抗病性的同時(shí), 也可改善目標(biāo)材料的脫水性、耐冷性, 對(duì)于培育高產(chǎn)廣適品種和資源創(chuàng)制具有重要指導(dǎo)意義。

數(shù)量抗性, 屬水平抗性, 在遺傳上受多基因控制, 對(duì)所有大斑病菌的生理小種均有效。大斑病數(shù)量抗性基因分布在玉米12條染色體上的整個(gè)基因組[11,17-18], 因其抗性持久且不易被新的生理小種克服而受到廣泛重視[19]。通過(guò)構(gòu)建不同的群體材料, 許多玉米抗大斑病 QTLs位點(diǎn)被定位[20-23],qNLB8.06DK888被精細(xì)定位在第 8染色體 0.46 MB的區(qū)間內(nèi),qNLB1.06被限定在3.60 MB的區(qū)間內(nèi)[24-25]。

A11和A24具有配合力高、耐密植等優(yōu)點(diǎn), 高抗大斑病且抗性穩(wěn)定, 年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比分別為5%和0; G02硬粒型, 稈韌性好, 抗倒性極強(qiáng), 高抗大斑病且抗性穩(wěn)定, 年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比有波動(dòng), 分別為0、1%和0 (表1)。以病情級(jí)別為指標(biāo), A11/獲白、A24/獲白和 G02/獲白的 F2群體抗、感植株比例既不完全符合 3∶1的分離比, 也不符合15∶1的分離比例(表2)。如果綜合考慮病情級(jí)別、病斑大小和年際間環(huán)境因素的影響, A11和G02對(duì)大斑病的抗性很有可能受數(shù)量性狀控制。但 A24三年鑒定沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病斑, 年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比均為 0, 其抗性遺傳規(guī)律有待做進(jìn)一步的深入研究, 以期發(fā)掘具有持久抗性且耐密、抗倒的玉米優(yōu)異資源。

盡管質(zhì)量抗性基因和數(shù)量抗性基因有著明顯的不同,但是在某些情況下, 質(zhì)量抗性基因更像是一個(gè)主效QTL[26-27]。F02和F05年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比有波動(dòng), 分別為1%、3%、3%和2%、1%、1%,而A04和R01年際間葉片上病斑面積占葉片總面積的百分比比較恒定, 分別為 1%和 4%(表 1), 但病斑數(shù)量、病斑長(zhǎng)度和寬度可能有差異。僅根據(jù)病情級(jí)別, A04、F02、F05和 R01對(duì)大斑病的抗性可能受一對(duì)顯性單基因控制,而如果綜合考慮病情級(jí)別、病斑大小、環(huán)境因素及多小種鑒定結(jié)果, A04、F02、F05和R01對(duì)大斑病的抗性也可能受少數(shù)主效 QTL控制, 存在微效基因的作用。質(zhì)量單基因或主效QTL定位將是下一步工作重點(diǎn)。

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