云南主要貿(mào)易類干巴菌遺傳多樣性分析*

周 汐，馮云利，陳正啟，余金鳳，吳素蕊，羅 瑞，桂明英

（中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

干巴菌是屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 蘑菇綱（Agaricomycetes） 革菌目 （Thelephorales） 革菌科（Thelephoraceae） 革菌屬（Thelephora） 的一類可食用真菌[1]。作為云南珍貴的野生食用菌，干巴菌憑借其獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)成為云南貿(mào)易類野生菌市場(chǎng)中不可或缺的一員[2]。

在云南地區(qū)，傳統(tǒng)廣義上的干巴菌包括革菌屬的6個(gè)種，蓮座革菌（Thelephora vialisSchwein）、干巴菌（Thelephora ganbajunM.Zang）、橙黃革菌（Thelephora aurantiotinctaCorner）、淡褐革菌 [Thelephora fuscella（Ces.）Lloyd]、日本革菌（Thelephora japonicaYasuda） 和掌狀革菌 [Thelephora palmate(Scop.)Fr.]。常見(jiàn)的主要有4種，蓮座革菌（T.vialis）、干巴菌 （T.ganbajun）、橙黃革菌 （T.aurantiotincta） 和掌狀革菌（T.palmate），主要產(chǎn)地為昆明、玉溪、曲靖、楚雄、普洱、麗江、保山和大理，分布區(qū)域大約位于北緯 22°～27°，東經(jīng) 99°～106°，海拔800m～2200m的范圍內(nèi)[3-4]。干巴菌僅在滇中及鄰近地區(qū)有食用習(xí)慣，且作為一種共生真菌，其生長(zhǎng)條件復(fù)雜，導(dǎo)致干巴菌的人工栽培難以實(shí)現(xiàn)，因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)此類真菌的研究成果不如其他菌類豐富，主要涉及分類鑒定、分離純化、營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定、生態(tài)學(xué)研究幾個(gè)方面，在分子生物學(xué)方面有部分研究但相對(duì)較少[5]。

本文通過(guò)對(duì)2015年至2016年，采集于野生環(huán)境中的34份貿(mào)易類干巴菌樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期了解貿(mào)易類干巴菌的種類、分布以及數(shù)量，從分子水平為云南貿(mào)易類干巴菌資源的開發(fā)與保護(hù)提供一定的理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)材料

自2015年至2016年，從云南貿(mào)易類干巴菌8個(gè)主產(chǎn)地中的普洱市、曲靖市馬龍縣、保山市、玉溪市元江縣、玉溪市峨山縣、玉溪市易門縣、玉溪市新平縣、大理州洱源縣、大理州祥云縣、楚雄市、楚雄州武定縣、昆明市富民縣、昆明市嵩明縣、昆明市宜良縣和昆明市尋甸縣采集貿(mào)易類干巴菌樣品40份。采集的樣本用硅膠干燥后備用。

1.2　試劑與儀器

1.2.1主要試劑

CTAB，TaKaRa Taq，ITS1/ITS4 引物，RV-M/M13-47引物，TaKaRa膠回收試劑盒，pMD18-T載體，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，Amp，IPTG，X-gal。

1.2.2主要儀器

凝膠成像儀，Gensnap公司；常溫高速離心機(jī)，SCILOGEX公司；PCR儀，ABI公司；電泳儀，六一生物科技有限公司；紫外透射儀，Benchtop公司；微型分光光度計(jì)，Nano Drop公司。測(cè)序服務(wù)由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

通過(guò)觀察形態(tài)特征和顯微結(jié)構(gòu)，按照傳統(tǒng)分類方法，參考黃年來(lái)、卯曉崗[6-7]對(duì)于革菌屬各個(gè)種的形態(tài)描述，初步確定每份樣品的屬種名。

1.3.2DNA提取

去除樣品表面的泥土等雜質(zhì)后用無(wú)菌去離子水和75%的酒精對(duì)樣品進(jìn)行清洗并粗略切割，吸干樣品表面液體后將樣品置于經(jīng)過(guò)高溫消毒的研缽中，加入液氮將樣品研磨至粉末，采用CTAB法提取樣品的DNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3PCR

利用真菌ITS通用引物對(duì)ITS1/ITS4對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)置反應(yīng)體系為Buffer 5μL，dNTP 4 μL，引物各1μL，Taq酶0.5μL，DNA模板1μL，無(wú)菌去離子水補(bǔ)足至50μL。設(shè)置PCR儀擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

1.3.4克隆

使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，割膠后使用膠回收試劑盒對(duì)含有目的DNA片段的回收膠條進(jìn)行純化。將純化產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用含有Amp/IPTG/X-gal的LB平板篩選陽(yáng)性單克隆，挑取單克隆于0.8mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng) 14 h～16 h。

1.3.5測(cè)序

使用pMD18-T載體上的引物對(duì)RV-M/M13-47對(duì)菌液進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目的條帶的菌液保存。將PCR驗(yàn)證有目的條帶的陽(yáng)性克隆送公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6序列分析

使用DNASTAR軟件包中的SeqMan程序，對(duì)照測(cè)序峰圖對(duì)序列進(jìn)行手動(dòng)校對(duì)，去除序列兩端多余的堿基，以確保序列的準(zhǔn)確性。通過(guò)Blast在線工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對(duì)，將測(cè)序獲得的序列同GenBank中已錄入的干巴菌（T.ganbajun） 以及革菌科（Thelephoraceae） 其他種序列進(jìn)行比對(duì)。

1.3.7系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

以銀耳（Tremella fucifomis） 作為外群，使用MAGA5.05軟件中的系統(tǒng)分析法（phylogeny）對(duì)序列進(jìn)行系統(tǒng)關(guān)系分析，采用鄰接法（neighbor-joining method，NJ） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)樹的每個(gè)分枝的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以Boot strap方法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000次，顯著性低于50%時(shí)，數(shù)值不在進(jìn)化樹中顯示。

1.3.8遺傳距離的計(jì)算

將測(cè)得的序列和從GenBank中通過(guò)BLAST檢索獲得的參考序列進(jìn)行多重對(duì)位排列，用MAGA5.05軟件中的Kimura-2-parameter（K2P） 模型計(jì)算遺傳距離，構(gòu)建距離矩陣。

1.3.9遺傳多樣性分析

使用軟件DnaSP 5.10對(duì)來(lái)自5個(gè)地理群的25個(gè)同種樣品進(jìn)行變異位點(diǎn)、單倍型數(shù)量、單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)果和分析

2.1　ITS序列鑒定結(jié)果

對(duì)經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為貿(mào)易類干巴菌的34個(gè)樣品的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果列于表1。

表1　ITS鑒定結(jié)果Tab.1　ITS identification result

在對(duì)測(cè)定序列進(jìn)行BLAST比對(duì)的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)3個(gè)樣品在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中只能比對(duì)到屬名（Thelephorasp.），為了確定其種名，根據(jù)文獻(xiàn)溯源，發(fā)現(xiàn)該種最初由Yagame等[8]在對(duì)小舌唇蘭與其伴生真菌的混合營(yíng)養(yǎng)模式的研究中被測(cè)序并登錄，登錄號(hào)為JF723272.1。同時(shí)，由于食用菌數(shù)量廣且形態(tài)多樣，利用單一的手段對(duì)某個(gè)菌種進(jìn)行鑒定會(huì)造成假陽(yáng)性[9-11]，影響后續(xù)研究，因此在本文的研究中，通過(guò)對(duì)采集的樣品進(jìn)行宏觀形態(tài)鑒定和顯微結(jié)構(gòu)觀察（圖1），將形態(tài)鑒定與ITS序列鑒定相結(jié)合，確定PE-2為橙黃革菌（T.aurantiotincta）。

圖1　PE-2形態(tài)鑒定Fig.1　Morphological identification of PE-2

在上述結(jié)論的基礎(chǔ)上，由表1可知，34份樣品的ITS序列長(zhǎng)度在640 bp左右，其中PE-2、YM-2和CX-1為橙黃革菌（T.aurantiotincta），EY-1以92%的相似率比對(duì)到掌狀革菌（T.palmate），其余30份樣品均為干巴菌（T.ganbajun）。

從地域分布看，昆明市周圍縣級(jí)地區(qū)8份樣品均為干巴菌（T.ganbajun）；玉溪市11份樣品以干巴菌（T.ganbajun） 為主，且于易門縣采集到1份橙黃革菌（T.aurantiotincta）；大理市的4份樣品除采集于洱源縣的1份掌狀革菌（T.palmate） 外，其他均為干巴菌（T.ganbajun）；楚雄州7份樣品中發(fā)現(xiàn)一份橙黃革菌（T.aurantiotincta） 其余6份為干巴菌（T.ganbajun）。而普洱市的兩份樣品中1份為干巴菌（T.ganbajun），另一份為橙黃革菌（T.aurantiotincta）。曲靖市的2份樣品均為干巴菌（T.ganbajun）。

2.2　系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

樣品的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析見(jiàn)圖2。

由圖2可知，EY-1與登錄號(hào)為KR019858.1的掌狀革菌聚為一支且與其他樣品親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；其次CX-1和YM-2與登錄號(hào)為JF723272.1的1個(gè)革菌屬序列親緣關(guān)系較近且與其他樣品親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)；其余樣品基本聚為一支，但仍呈現(xiàn)出一定的個(gè)體差異。

2.3　干巴菌遺傳多樣性分析

干巴菌（T.ganbajun）樣品的遺傳多樣性分析如表2所示。

圖2　基于ITS的云南主要貿(mào)易類干巴菌樣品間的NJ系統(tǒng)樹Fig.2　NJphylogenetic tree ofmain trading Thelephora samples in Yunnan based on ITS

表2　干巴菌遺傳多樣性分析Tab.2　Genetic diversity analysis of Thelephora ganbajun M.Zang

表2數(shù)據(jù)顯示，5個(gè)地區(qū)的干巴菌均顯示出一定的遺傳多樣性，尤其玉溪的樣品最為明顯，單倍型數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最多，以9個(gè)樣品達(dá)到了0.722的單倍型多樣性。

2.4　貿(mào)易類干巴菌遺傳距離分析

主要貿(mào)易類干巴菌樣品間的遺傳距離見(jiàn)表3。

從表3可以看出，通過(guò)遺傳距離的計(jì)算得知，云南地區(qū)貿(mào)易類干巴菌的總體遺傳距離范圍為0.000～0.165；樣品EY-1和YM-2之間的遺傳距離與EY-1和CX-1之間的遺傳距離均達(dá)到了0.165，表明橙黃革菌（T.aurantiotincta） 與掌狀革菌（T.palmate）之間存在明顯的種間差異；EY-1與其他干巴菌（T.ganbajun） 樣品的遺傳距離分別能達(dá)到0.126、0.114、0.116、0.110、0.136 和 0.130，說(shuō)明掌狀革菌（T.palmate） 與干巴菌（T.ganbajun） 之間存在較大的種間差異；YM-2/CX-1和其他干巴菌（Thelephora ganbajun） 樣品之間的遺傳距離范圍在0.091～0.111，說(shuō)明掌狀革菌（T.palmate） 與干巴菌（T.ganbajun） 之間存在種間差異；YM-2與CX-2的遺傳距離有0.005，說(shuō)明橙黃革菌（T.aurantiotincta） 種內(nèi)存在一定差異；其他干巴菌（T.ganbajun） 樣品相互之間的遺傳距離范圍在 0.000～0.047，0.047的遺傳距離存在于SM-1和CX-4之間，說(shuō)明云南各地干巴菌（T.ganbajun）種內(nèi)也有顯著差異。

3　結(jié)論與討論

本文從云南8個(gè)貿(mào)易類干巴菌主產(chǎn)地采集了34份樣品，覆蓋了15個(gè)區(qū)縣。通過(guò)ITS序列分析，確認(rèn)34份樣品中有30份樣品為干巴菌（T.ganbajun），說(shuō)明云南地區(qū)貿(mào)易類干巴菌以干巴菌（T.ganbajung）為主要種。除干巴菌外，掌狀革菌（T.palmate） 和橙黃革菌（T.aurantiotincta）亦有分布但資源較為稀缺。說(shuō)明云南地區(qū)貿(mào)易類干巴菌具有一定的多樣性，但本次研究中體現(xiàn)出多樣性不豐富。

系統(tǒng)發(fā)育樹及遺傳距離分析顯示，干巴菌（T.ganbajun）、掌狀革菌（T.palmate） 和橙黃革菌（T.aurantiotincta）分散為3支，且干巴菌的一個(gè)大支分為了3個(gè)小支，但與地域差異關(guān)聯(lián)不明顯，種間有明顯差距，種內(nèi)有一定差距。

在本次研究中，掌狀革菌（T.palmate） 樣品EY-1采集于云南省大理州洱源縣的針闊混交林，片段長(zhǎng)度為631 bp，以92%的相似性比對(duì)到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄號(hào)為KR019858.1的序列。另外3份橙黃革菌（T.aurantiotincta） 樣品中，PE-2采集自云南省普洱市倚象鎮(zhèn)石膏箐的混交林，片段長(zhǎng)度為622，以99%的相似率比對(duì)到JF723272.1；YM-2采集自云南省玉溪市易門縣的松純林，片段長(zhǎng)度為622，以99%的相似率比對(duì)到JF723272.1；CX-1采集自楚雄彝族自治州的針闊混交林，片段長(zhǎng)度為622，同樣以99%的相似率比對(duì)到JF723272.1。參考前人的研究[12-14]，本文認(rèn)為從生物多樣性角度出發(fā)，這兩種菌種產(chǎn)量較小且分布零星，應(yīng)加大保護(hù)力度并嘗試進(jìn)行原生境菌種栽培方面的探索。蓮座革菌（T.vialis）、淡褐革菌（T.fuscella） 和日本革菌（T.japonica） 3個(gè)種在本次研究中并未發(fā)現(xiàn)，期望在今后的試驗(yàn)中通過(guò)擴(kuò)大采樣區(qū)域、采樣密度，增加樣品數(shù)量得以發(fā)現(xiàn)。

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