胞內(nèi)菌抗酸染色法檢測(cè)體液標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的應(yīng)用價(jià)值

楊翰　崔曉利　李愛芳　尤震宇　談小文　黨麗云

目前，結(jié)核病在全球范圍內(nèi)發(fā)病及死亡呈緩慢上升趨勢(shì)。據(jù)2016年11月10日WHO最新數(shù)據(jù)報(bào)道，全球2016年結(jié)核病發(fā)病1040萬例，死亡(含HIV感染患者)130萬例；其中中國(guó)發(fā)病89.5萬例，死亡5萬例(含HIV感染患者)[1]。隨著結(jié)核病的日趨嚴(yán)重，目前對(duì)結(jié)核病的檢測(cè)主要集中在早期對(duì)結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)的循證及藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)的檢測(cè)上。肺部的結(jié)核感染，因?yàn)樘狄簶?biāo)本易取，往往通過大量集菌痰液而提高結(jié)核分枝桿菌的檢出陽性率；而肺外的結(jié)核感染，例如結(jié)核性胸腹膜炎和結(jié)核性腦膜炎，采集樣本不僅需要有創(chuàng)檢查，并且由于采集樣本量少而缺乏臨床診斷價(jià)值，因此對(duì)病原學(xué)檢出的限制就更多，要求則更高。結(jié)核分枝桿菌的胞內(nèi)細(xì)菌染色[2-3]是一種利用離心沉淀器將腦脊液、胸腹腔積液標(biāo)本中細(xì)胞等有形成分離心固定在玻片上，通過破膜液破壞白細(xì)胞細(xì)胞膜，使得染色劑更加容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而提高細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的染色效果；與普通抗酸染色比較，該方法不僅可以觀察到在白細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，還可觀察到細(xì)胞外的結(jié)核分枝桿菌，提高了腦脊液、胸腹腔積液標(biāo)本的凃片陽性檢出率。筆者通過結(jié)核分枝桿菌的白細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)菌抗酸染色(簡(jiǎn)稱“胞內(nèi)菌法”)，結(jié)核分枝桿菌BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)(簡(jiǎn)稱“MGIT 960培養(yǎng)”)及聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR)熒光探針法(簡(jiǎn)稱“PCR法”)分別對(duì)結(jié)核性胸腹膜炎及結(jié)核性腦膜炎患者標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，以期找到一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)且又能夠滿足陽性檢出率要求的方法。

材料和方法

1.材料情況：收集2013年4月至2015年4月西安市胸科醫(yī)院收治的1236例疑似結(jié)核病患者的腦脊液、胸腹腔積液標(biāo)本，其中腦脊液(CSF)237份，胸腹腔積液999份。參照《WS 288-2017肺結(jié)核診斷》[4]《結(jié)核性腦膜炎診治指南》(Thwaites 診斷標(biāo)準(zhǔn))[5]，共臨床診斷1022例(82.69%)。以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，回顧性分析各方法對(duì)不同標(biāo)本的檢測(cè)效能。

2.儀器和試劑：FMV-6微型細(xì)胞玻片離心沉淀器，低速離心機(jī)，光學(xué)顯微鏡，抗酸染色試劑盒(批號(hào)：412091；珠海貝索生物有限公司)，0.1 mol/L磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 7.5，貨號(hào)：W17D0619KH，科昊生物工程有限責(zé)任公司)，破膜液(0.3% Triton X-100，貨號(hào)：T8200， Solarbio)，甲醛丙酮固定液(貨號(hào)：RLG2625，上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司)，結(jié)核分枝桿菌抗原檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：TB140701、TB150902；杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)，分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：0108141504；北京博奧生物科技有限公司)，ABI7300熒光定量PCR儀(美國(guó)應(yīng)用生物公司)，結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)試劑盒(BD醫(yī)療器械有限公司)，液體培養(yǎng)系統(tǒng)(BACTECTMMGIT 960操作系統(tǒng))。

3.胞內(nèi)菌抗酸染色[6]：根據(jù)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[7]收集標(biāo)本。胞內(nèi)細(xì)菌染色步驟：(1)涂片：取0.5 ml體液標(biāo)本加入FMV-6微型細(xì)胞玻片離心沉淀器的沉淀管中，50×g離心3 min，待體液標(biāo)本的有形成分完全沉淀到掛膠玻片上；(2)固定：將涂片浸于固定液中30 s，水洗，晾干；(3)破膜：固定后的涂片浸泡于0.3% Trition X-100破膜液中30 min，0.1 mol/L PBS緩沖液洗3次；(4)晾干、染色：石碳酸復(fù)紅染液初染5 min，水洗，3%鹽酸酒精脫色1 min，水洗，美藍(lán)染液復(fù)染1 min，水洗，晾干；(5)顯微鏡下觀察抗酸染色情況：分枝桿菌呈紅色，背景為藍(lán)色(圖1)。

圖1　胞內(nèi)菌法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)外結(jié)核分枝桿菌(改良抗酸染色10×100)。下方箭頭：細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌；上方箭頭：細(xì)胞外分枝桿菌

4.胸腹腔積液標(biāo)本分枝桿菌MGIT 960培養(yǎng)：6% NaOH溶液與胸腹腔積液標(biāo)本各2 ml以1∶1混合(NaOH終濃度達(dá)到3%)加入到50 ml離心管中，靜置15 min，加入0.1 mol/L PBS至45 ml，相對(duì)離心力 3000×g離心20 min，棄上清，加入1 ml 0.1 mol/L PBS混勻，接種0.5 ml至MGIT 960培養(yǎng)管中，置于MGIT 960培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d。若MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽性，取出再經(jīng)涂片抗酸染色確認(rèn)是否為分枝桿菌，抗酸陽性則進(jìn)行MPB64蛋白免疫膠體金法檢測(cè)鑒定菌種，MPB64蛋白陽性為結(jié)核分枝桿菌，陰性為非結(jié)核分枝桿菌；若MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陰性，則為分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

5.CSF標(biāo)本分枝桿菌液體培養(yǎng)：取0.5 ml清亮CSF無菌操作直接倒入MGIT 960培養(yǎng)管中，肉眼可見明顯渾濁CSF標(biāo)本(若CSF標(biāo)本>2 ml，離心沉淀?xiàng)壣锨灞Ａ? ml；若CSF標(biāo)本<2 ml，則使用全部量標(biāo)本)與等量6% NaOH溶液混合(NaOH終濃度達(dá)到3%)加入到50 ml離心管中，靜置15 min，再加入0.1 mol/L PBS至45 ml，相對(duì)離心力3000×g離心20 min，棄上清，加入1 ml PBS混勻，接種0.5 ml至MGIT 960培養(yǎng)管中，置于MGIT 960培養(yǎng)箱中培養(yǎng)42 d[8]。若MGIT 960報(bào)陽性，取出涂片抗酸染色確認(rèn)是否為分枝桿菌，抗酸陽性則進(jìn)行MPB64蛋白抗原檢測(cè)鑒定菌種，MPB64蛋白陽性為結(jié)核分枝桿菌，陰性為非結(jié)核分枝桿菌；若MGIT 960報(bào)陰性，則分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

6.MPB64蛋白免疫膠體金法檢測(cè)方法[9]：取100 μl液體培養(yǎng)基菌懸液加入到試劑檢測(cè)孔中，15 min 后觀察，1 h內(nèi)判定結(jié)果。結(jié)果判讀：檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性；質(zhì)控線出現(xiàn)，但檢測(cè)線未出現(xiàn)紫紅色條帶者為陰性；質(zhì)控線未出者表示試劑存在問題，須重新檢測(cè)

7.PCR-熒光探針法[10-11]：是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的一種分子生物學(xué)方法，本研究簡(jiǎn)稱“PCR法”。取1 ml標(biāo)本加入1.5 ml離心管中，15 000×g離心5 min，棄上清，加入1 ml生理鹽水渦旋震蕩后，15 000×g離心5 min，棄上清。向沉淀中加入50 μl核酸提取液并轉(zhuǎn)入帶磁珠的核酸提取管中，提取儀快速震蕩10 min，然后95 ℃水浴5 min。取2 μl提取好的核酸溶液加入18 μl PCR擴(kuò)增試劑中，進(jìn)行擴(kuò)增：37 ℃、300 s(1個(gè)循環(huán))，94 ℃、180 s(1個(gè)循環(huán))，94 ℃、15 s(40個(gè)循環(huán))，60 ℃、30 s(40個(gè)循環(huán))，50 ℃、10 s(1個(gè)循環(huán))；熒光采集點(diǎn)選擇60 ℃、30 s，同時(shí)檢測(cè)羥基熒光素(FAM)通道(結(jié)核分枝桿菌拷貝通道)和5-六氯熒光素氨基磷酸酯(5-hexachloro-fluorescein，HEX)通道(分枝桿菌拷貝通道)。結(jié)果判讀：樣本曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)Ct值<40的樣本為陽性，Ct值>40或無數(shù)值的為陰性，檢測(cè)結(jié)果的解釋[12-13]，見表1。

表1　PCR法結(jié)果解釋

注“+”為陽性(Ct值<40)；“-”為陰性(Ct值>40或無數(shù)值)

9.相關(guān)公式：敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；一致性=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/總例數(shù)×100%。

結(jié)　　果

1.不同標(biāo)本經(jīng)3種方法檢測(cè)的結(jié)果分析：MGIT 960培養(yǎng)法、PCR法和胞內(nèi)菌法檢測(cè)經(jīng)臨床診斷的999份胸腹腔積液和237份CSF的結(jié)果見表2。

2.胞內(nèi)菌法與MGIT 960培養(yǎng)、PCR法的比較：統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在對(duì)胸腹腔積液和CSF標(biāo)本的檢測(cè)中，胞內(nèi)菌法、MGIT 960培養(yǎng)、PCR法的陽性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

3.評(píng)價(jià)3種方法的檢測(cè)效能：以最終臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合表2中的數(shù)據(jù)，計(jì)算3種方法對(duì)不同標(biāo)本的檢測(cè)效能。結(jié)果顯示，3種方法特異度均為100.00%；而3種方法的敏感度差異較大，其中胞內(nèi)菌法在3種檢測(cè)方法中有著良好的敏感度，在CSF中其敏感度要高于其他兩種方法(表4)。

表2　3種方法對(duì)不同標(biāo)本類型的檢測(cè)結(jié)果[例(率，%)]

表3　3種方法對(duì)不同標(biāo)本陽性檢出率的比較 [陽性份數(shù)(率，%)]

表4　以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)3種方法對(duì)不同標(biāo)本類型的檢測(cè)效能(%)

注敏感度=真陽性份數(shù)/(真陽性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%；特異度=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陽性份數(shù))×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性份數(shù)/(真陽性份數(shù)+假陽性份數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性份數(shù)/(真陰性份數(shù)+假陰性份數(shù))×100%；一致性=(真陽性份數(shù)+真陰性份數(shù))/總份數(shù)×100%

討　　論

結(jié)核病的診斷以培養(yǎng)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，加之后續(xù)的菌種鑒定和體外藥敏試驗(yàn)，對(duì)臨床的應(yīng)用價(jià)值較高。但傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)結(jié)核病的早期診斷治療帶來影響?？顾崛旧科R檢，因操作方便、實(shí)驗(yàn)無需特別儀器、價(jià)格低廉，在基層及專科醫(yī)院可常規(guī)開展，其陽性結(jié)果可作為病原學(xué)診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)；但抗酸染色涂片法陽性率低，大量涂陰患者不能排除結(jié)核病，容易被忽視而造成某些結(jié)核病患者的漏診和漏治問題。近年來，DNA、RNA等分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展使得結(jié)核分枝桿菌的檢出時(shí)間大大縮短，但由于配套的相關(guān)設(shè)備及儀器價(jià)格昂貴，技術(shù)要求高，不適用于基層醫(yī)院的廣泛開展。因此，尋找一種檢測(cè)周期短、檢出陽性率高，且價(jià)格低廉的臨床檢測(cè)方法，對(duì)結(jié)核性胸腹膜炎、結(jié)核性腦膜炎等肺外結(jié)核的普查和在基層醫(yī)院的應(yīng)用意義重大。

結(jié)核分枝桿菌為兼性胞內(nèi)菌，細(xì)胞內(nèi)抗酸染色與傳統(tǒng)的抗酸染色法相比，既可以破壞白細(xì)胞細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜穿孔，使得染液易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，便于對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的染色觀察，也可以同時(shí)檢測(cè)到細(xì)胞外的結(jié)核分枝桿菌(圖1)；而傳統(tǒng)染色法，染色液較難進(jìn)入。因此，在進(jìn)行不同上述標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，該方法可以有效地觀察到白細(xì)胞吞噬的已著色分枝桿菌，其陽性檢出率明顯高于傳統(tǒng)抗酸染色法[15-16]。

本研究中，對(duì)于胸腹腔積液等易采集且樣本量大的標(biāo)本，胞內(nèi)菌法檢測(cè)有著較高的陽性率(11.81%)，接近培養(yǎng)陽性率(16.02%)，高于PCR法(6.01%)。對(duì)疑似結(jié)核性腦膜炎的患者進(jìn)行篩查時(shí)，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)菌法的檢測(cè)陽性率(14.77%)要明顯高于MGIT 960培養(yǎng)法(8.02%)和PCR法(2.11%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢钥闯?，在標(biāo)本量足夠(如胸腹腔積液)的情況下，胞內(nèi)菌法檢測(cè)可以達(dá)到，甚至高于MGIT 960培養(yǎng)法的陽性率。而臨床中常遇到標(biāo)本量較少的情況(如CSF)，此時(shí)胞內(nèi)菌法的陽性率要明顯優(yōu)于培養(yǎng)的方法，其原因可能為胞內(nèi)菌法檢測(cè)可以將標(biāo)本中所有細(xì)胞的有形成分固定于玻片，破膜后白細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌更加容易著色，肉眼即可以觀察到所有染色成分，提高了陽性檢出率；而MGIT 960培養(yǎng)法對(duì)于前處理水平、含菌量、細(xì)菌生存狀態(tài)(活菌、死菌)的要求較高，所以在小樣本量時(shí)，胞內(nèi)菌檢測(cè)方法優(yōu)勢(shì)明顯。

本研究中，PCR法檢測(cè)陽性率明顯低于其他2種檢測(cè)，原因可能為結(jié)核分枝桿菌在胸腹腔積液、CSF中本身含量太少，在操作時(shí)樣本量少而無法進(jìn)行大量的集菌，單次吸取的樣本含菌量少，可提取到的DNA含量達(dá)不到檢測(cè)限。有文獻(xiàn)報(bào)道，巣式PCR檢測(cè)線應(yīng)達(dá)到104～108拷貝/ml，PCR試劑盒檢出閾值要達(dá)到100條菌/樣本才可檢測(cè)出[17-18]。而胞內(nèi)菌法觀察全視野，可檢測(cè)到低至1條的結(jié)核分枝桿菌。因此，在條件允許的情況下，CSF、胸腹腔積液標(biāo)本進(jìn)行PCR法檢測(cè)時(shí)應(yīng)當(dāng)進(jìn)行濃縮集菌，以提高陽性率。

本研究中，MGIT 960培養(yǎng)是診斷分枝桿菌病的金標(biāo)準(zhǔn)；胞內(nèi)菌法是一種改良抗酸染色法，即查找抗酸染色陽性分枝桿菌，也是診斷分枝桿菌病的重要參考；PCR檢測(cè)陽性同時(shí)影像學(xué)檢查結(jié)果支持可臨床診斷為結(jié)核病。MGIT 960培養(yǎng)與胞內(nèi)菌法檢測(cè)陽性僅代表分枝桿菌陽性，還需進(jìn)行菌種鑒定以區(qū)別結(jié)核病與非結(jié)核分枝桿菌病，以免造成誤診。筆者單位為結(jié)核病三級(jí)甲等?？漆t(yī)院，患者大多數(shù)由下級(jí)醫(yī)院根據(jù)《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》中的標(biāo)準(zhǔn)診斷為結(jié)核病疑似患者時(shí)才轉(zhuǎn)診至我院，且未確診的患者大多為具有惡性腹腔積液或流行性腦膜炎者；另外，我院地處中國(guó)西北部，非結(jié)核分枝桿菌病較為少見，感染率僅為1.5%(3/201)[19]，故在本次研究患者中未分離出非結(jié)核分枝桿菌。因此，3種方法特異度與陽性預(yù)測(cè)值在本次研究中均為100.00%。綜合性醫(yī)院在使用以上3種方法時(shí)，若檢測(cè)結(jié)果陽性時(shí)應(yīng)當(dāng)注意參照《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》中的標(biāo)準(zhǔn)做出結(jié)核病或者非結(jié)核分枝桿菌病的診斷。

綜上所述，胞內(nèi)菌法檢測(cè)在實(shí)際臨床應(yīng)用中對(duì)體液標(biāo)本有明顯高于傳統(tǒng)的抗酸染色的陽性率，且不亞于或高于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性率，尤其在小樣本量的標(biāo)本如CSF、心包積液等應(yīng)用價(jià)值較高。其設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)單，樣本量要求少，特別適用于廣大的基層?？漆t(yī)院及綜合性醫(yī)院?？茖?duì)結(jié)核性腦膜炎、胸腹膜炎的篩查診斷。但胞內(nèi)菌法僅能為結(jié)核病的診斷提供參考依據(jù)，而無法像結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)與PCR那樣對(duì)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性進(jìn)行分析。

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