蛹蟲草搖瓶菌種培養(yǎng)基的優(yōu)化

龍海濤，劉 標(biāo)，顏小明，郝繼偉

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東臨沂 276000)

蛹蟲草，又名北蟲草，學(xué)名北冬蟲夏草，因其化學(xué)成分和藥理作用與冬蟲夏草相似[1-2]，在臨床上常代替冬蟲夏草入藥[3]。現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究證明，蟲草中含有蟲草素、蟲草酸以及各種氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有滋肺補(bǔ)腎、止血化痰、抗各類細(xì)菌、提高免疫力、降血壓等功效，具有較高的食用和藥用價值[4-5]。

蛹蟲草經(jīng)多年研究，現(xiàn)已實現(xiàn)規(guī)模化人工培養(yǎng)和深層發(fā)酵2種應(yīng)用方式。規(guī)模化人工培養(yǎng)既可為人們提供大量的蟲草子實體(子座)，又可為提取蟲草素、蟲草多糖等活性物質(zhì)提供原材料，而人們通過深層發(fā)酵可直接從菌絲體以及發(fā)酵液中提取有效成分[6]。但不論哪一種應(yīng)用方式，高質(zhì)量、高標(biāo)準(zhǔn)的搖瓶菌種都是生產(chǎn)中最重要的一個環(huán)節(jié)。鑒于蛹蟲草在臨沂研究較少、尚未大面積推廣的現(xiàn)狀，筆者在許慶國等[7]、王戰(zhàn)勇等[8]研究的基礎(chǔ)上，以當(dāng)?shù)刂髟云贩N為研究對象，嘗試尋找復(fù)合碳源和復(fù)合氮源與無機(jī)鹽最佳配比，以優(yōu)化搖瓶菌種培養(yǎng)基，為后繼研究和生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試材料

1.1.1菌種。采自費縣盛成農(nóng)業(yè)科技有限公司的蛹蟲草子座，通過組織分離法得到試管母種。

1.1.2儀器設(shè)備。VS-840KVU型生物超凈工作臺(蘇州安泰)；HZQ-Q型全溫振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；YXQ-LS-50S Ⅱ 型全自動立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；FA2004N型電子天平(蘇州安泰)；010A-1E型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實驗儀器總廠)等。

1.1.3培養(yǎng)基。

1.1.3.1母種培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、KH2PO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，水1 000 mL。

1.1.3.2液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)基。葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。

1.1.3.3碳源初選培養(yǎng)基。分別以20 g/L蔗糖、20 g/L乳糖、20 g/L可溶性淀粉、200 g/L馬鈴薯、200 g/L紅薯取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖為碳源，pH自然。

1.1.3.4氮源初選培養(yǎng)基。分別以10 g/L酵母浸膏、20 g/L 麥麩、10 g/L牛肉浸膏、10 g/L豆粕取代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨為氮源，pH自然。

1.2試驗方法

1.2.1斜面菌種制備。蛹蟲草子座經(jīng)消毒后，在其內(nèi)部取0.5 cm2左右大小的組織塊，在無菌條件下接種到斜面培養(yǎng)基中部，置于23 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d左右，即可得蛹蟲草的斜面菌種。挑選無污染、健壯的菌種備用。

1.2.2液體菌種制備。將配制好的液體培養(yǎng)基，按每瓶150 mL的量倒入干凈的250 mL三角瓶中，用透氣封口膜封口并用牛皮紙包裹瓶口，于121 ℃下滅菌20 min。冷卻后，通過無菌操作取1塊0.5～1.0 cm2的母種塊接入液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。20 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，在瓶中即可看到大量菌球形成。

1.2.3發(fā)酵試驗。無菌條件下按10%(V/V)的接種量用無菌吸管吸取液體菌種，接種于滅菌后的相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，20 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)6 d。

1.2.4菌絲重量測定。發(fā)酵試驗后將無污染三角瓶中的菌體與培養(yǎng)液的混合物置于孔徑為0.125 mm的網(wǎng)篩上過篩，用蒸餾水沖洗3次后，置于60 ℃干燥箱內(nèi)至干燥至恒重，稱重。

1.3試驗設(shè)計

1.3.1碳氮源初選試驗。以蛹蟲草菌絲干質(zhì)量為指標(biāo)，以液體菌種基礎(chǔ)培養(yǎng)為對照，分別通過碳源初選培養(yǎng)基和氮源初選培養(yǎng)基，篩選出適宜于蛹蟲草液體發(fā)酵的碳源和氮源各2種。

1.3.2碳氮源正交法優(yōu)選試驗。根據(jù)碳氮源初選試驗結(jié)果分別選擇表現(xiàn)最好的2種碳源和2種氮源作為4個試驗因素，并分別取3種適宜濃度作為3個水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行碳氮源的優(yōu)化組合試驗。

1.3.3無機(jī)鹽及維生素正交優(yōu)選試驗。以優(yōu)化碳氮源配比為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以KH2PO4、MgSO4·7H2O以及VB1為3個試驗因素，并分別取3種濃度為3個水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行常用無機(jī)鹽與VB1的優(yōu)化組合試驗，試驗設(shè)計見表1。

表1無機(jī)鹽與VB1正交優(yōu)化試驗因素與水平

Table1FactorsandleveloforthogonaloptimizationtestofinorganicsaltandVB1

水平Level因素FactorAKH2PO4g/LBMgSO4·7H2Og/L空列Vacantcolumn D VB1 g/L10.50.5—021.01.0—0.0531.51.5—0.10

2　結(jié)果與分析

2.1碳氮源初選試驗結(jié)果碳氮源初選試驗結(jié)果見圖1、2。經(jīng)初級篩選得到最佳碳源為紅薯和可溶性淀粉；經(jīng)初級篩選得到最佳氮源為酵母膏和牛肉膏。

圖1　碳源初選試驗結(jié)果Fig.1　Primary selection test result of carbon source

圖2　氮源初選試驗結(jié)果Fig.2　Primary selection test result of nitrogen source

2.2碳氮源優(yōu)化試驗結(jié)果根據(jù)碳氮源初選試驗結(jié)果，參與碳氮源優(yōu)化試驗的試驗因素及水平見表2。

由表3極差分析結(jié)果可知，紅薯取第1水平、可溶性淀粉取第2水平、牛肉膏取第2水平、酵母膏取第2水平為最佳配方。即蛹蟲草液體培養(yǎng)基最佳氮源配比為紅薯50 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L。根據(jù)極差R值大小可知，4個試驗因素對試驗指標(biāo)影響程度的大小排序為牛肉膏、紅薯、酵母膏、可溶性淀粉。

表2碳氮源正交優(yōu)化試驗因素與水平

Table2Factorsandleveloforthogonaloptimizationtestofcarbonsourceandnitrogensource

水平Level因素FactorA紅薯SweetpotatoB可溶性淀粉SolublestarchC牛肉膏BeefextractD酵母膏Yeastextract15055521001010103150151515

表3碳氮源正交試驗極差分析結(jié)果

Table3Rangeanalysisresultsoforthogonaltestofcarbonsourceandnitrogensource

試驗號No.A紅薯SweetpotatoB可溶性淀粉SolublestarchC牛肉膏BeefextractD酵母膏Yeastextract菌絲干質(zhì)量Dryqualityofmyceliumg/L1111126.042122232.843133316.514212323.365223119.476231226.477313217.678321320.499332118.58K125.1322.3624.3321.36K223.1024.2724.9325.66K318.9120.5217.8820.12R6.223.757.045.54

2.3無機(jī)鹽及維生素正交優(yōu)選試驗結(jié)果由表4極差分析結(jié)果可知，最佳無機(jī)鹽配比為KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB10.10 g/L。根據(jù)極差R值大小可知，4個試驗因素對試驗指標(biāo)影響程度的大小排序為KH2PO4、MgSO4·7H2O、VB1。

2.4優(yōu)化配方驗證試驗結(jié)果以表4中菌絲產(chǎn)量最大的配方即紅薯50 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L，VB10.10 g/L，驗證正交試驗優(yōu)化配方，試驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明，優(yōu)化配方菌絲產(chǎn)量為36.33 g/L，高于對照11.31%，達(dá)極顯著水平。

表4無機(jī)鹽及VB1正交試驗極差分析結(jié)果

Table4RangeanalysisresultsoforthogonaltestofinorganicsaltandVB1

試驗號No.AKH2PO4BMgSO4·7H2O空列VacantcolumnDVB1菌絲干質(zhì)量Dryqualityofmyceliumg/L1111126.332122230.753133322.794212331.685223133.736231231.077313233.528321336.269332129.09K126.6230.5131.2229.72K232.1633.5830.5131.78K332.9627.6530.0130.24R6.335.931.212.06

3　討論與結(jié)論

在類似的蛹蟲草液體菌種培養(yǎng)基優(yōu)化研究中，許慶國等[7]認(rèn)為馬鈴薯和蔗糖為最優(yōu)碳源，牛肉膏和蛋白胨為最優(yōu)氮源；鄒湘月等[9]認(rèn)為最佳碳源為玉米粉，最佳氮源為麩皮。該研究的蛹蟲草液體菌種最佳配方為紅薯50 g/L、可溶性淀粉10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、VB10.10 g/L，主要碳氮源與許慶國等[7]、鄒湘月等[8]不同。分析最主要的原因是菌種差異，其次是培養(yǎng)條件所致。此外，由于配制培養(yǎng)基所利用的各種農(nóng)產(chǎn)品地域及品種的不同以及牛肉膏、蛋白胨等復(fù)合材料生產(chǎn)廠家和生產(chǎn)原料的差異，其有效成分均有所不同[10]。

該研究配方在20 ℃、120 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)6 d，菌絲干質(zhì)量可達(dá)36.33 g/L，較許慶國等[7]的研究結(jié)果明顯偏高，表明當(dāng)?shù)赜枷x草品種應(yīng)用該配方有較高的生產(chǎn)潛力，該研究成果對促進(jìn)地方蛹蟲草生產(chǎn)與推廣有一定的應(yīng)用價值。

表5　優(yōu)化配方驗證試驗結(jié)果

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Note:Different small letters within the same column mean significant differences (P<0.05),different capital letters within the same column show extremely significant differences (P<0.01)

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