一株產(chǎn)耐高溫β-甘露聚糖酶菌株的篩選鑒定

羅長(zhǎng)財(cái)，繆靜，李國瑩，杜瑤，余曉斌

1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；

2.魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025

β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，是一種能降解β-1，4-甘露糖苷鍵的水解酶，可應(yīng)用于飼料、食品加工、生物能源、紡織、造紙、石油開采等領(lǐng)域[1-2]。

采用微生物生產(chǎn)β-甘露聚糖酶，具有表達(dá)量高、易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)及后處理、生產(chǎn)成本相對(duì)低廉等特點(diǎn)，因而成為β-甘露聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)的主要方式[3]。目前已有來源于黑曲霉（Asper?gillus niger）[4]、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）[5]、費(fèi)氏新薩托菌（Neosartorya fischeri）[6]、硫色曲霉（A.sulphureus）[7]、熱桿梭菌（Clostridium thermocel?lum）[8]等菌種的β-甘露聚糖酶獲得表達(dá)及應(yīng)用。

β-甘露聚糖酶在工業(yè)化應(yīng)用時(shí)，經(jīng)常會(huì)涉及到高溫處理過程，而導(dǎo)致酶失活。因此，為滿足各種工業(yè)應(yīng)用要求，提高β-甘露聚糖酶的耐高溫性能一直是急需解決的問題。

近年來，一些極端環(huán)境下生長(zhǎng)的微生物被分離、篩選出來，如從海底火山口的硫磺礦區(qū)分離出來的極端鐵代謝嗜熱菌Pyrodictium abyssi，可在80～110℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)[9]。這些可耐受極端環(huán)境的微生物蘊(yùn)藏著豐富的酶基因資源[10]，因此，尋找產(chǎn)β-甘露聚糖酶的嗜熱菌，就成為開發(fā)耐高溫β-甘露聚糖酶的有效途徑。

我們從熱泉（水溫高于68℃）中分離、篩選出一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的極端嗜熱細(xì)菌。在本研究中，我們采用多種方法鑒定出該菌為一種極端嗜熱的枯草芽胞桿菌。另外，通過對(duì)該菌所產(chǎn)β-甘露聚糖酶進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)其耐高溫性能良好。

1 材料與方法

1.1 材料

槐豆膠（G0573）購自Sigma-Aldrich公司；酵母粉、胰蛋白胨購自O(shè)xoid公司；魔芋精粉購自湖北強(qiáng)森魔芋科技有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司。

富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.5 g/L，酵母粉1 g/ L，氯化鈉1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KCl 0.5 g/ L，KH2PO40.5 g/L，F(xiàn)eCl31 g/L，CaCl20.23 g/L，（NH4）2SO41 g/L，pH7.0。

LB瓊脂篩選固體培養(yǎng)基[11]：胰蛋白胨10 g/ L，酶母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，槐豆膠6 g/L，剛果紅5 g/L，瓊脂粉20 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酶母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L（LB液體培養(yǎng)基不含瓊脂）。

發(fā)酵培養(yǎng)基：磨芋精粉20 g/L，（NH4）2SO410 g/L，NaNO35 g/L，MgSO4·7H2O 2.5 g/L，KH2PO41.5 g/L。

恒溫恒濕培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；紫外-可見光分光光度計(jì)（島津公司）；梯度PCR擴(kuò)增儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）。

1.2 菌體富集培養(yǎng)及篩選

將取自熱泉（位于江西省撫州市境內(nèi)，水溫高于68℃）出水口處的水樣及泥沙樣本于無菌條件下分別接入富集培養(yǎng)基中，60℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)物涂布LB瓊脂篩選固體培養(yǎng)基，于42℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察 將篩選出的單菌落于LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后觀察菌落特征，并送江南大學(xué)分析測(cè)試中心進(jìn)行電鏡檢測(cè)。

1.3.2 生理生化培養(yǎng)鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]及《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》[13]中的鑒定方法，對(duì)篩選出的產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌種進(jìn)行生理生化檢測(cè)，初步完成菌種鑒定。

1.3.3 16S rDNA鑒定 采用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，提取所篩選菌株的基因組DNA，利用通用引物27F（AGAGTTTGATCCTCGC TCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94℃預(yù)變性3 min；94℃變性60 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min），獲得目標(biāo)菌株的16S rDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后，送上海生工公司測(cè)序，所測(cè)定的16S rDNA序列通過NCBI進(jìn)行比對(duì)，尋找同源性高的序列，再利用MEGA5.2軟件繪制出該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌體在不同溫度、pH值下的生長(zhǎng)測(cè)試

在30～85℃及不同pH值條件下，分別采用LB液體培養(yǎng)基以200 r/min培養(yǎng)24 h，8000×g離心10 min，菌體于120℃烘干至恒重，檢測(cè)不同條件下的菌體生長(zhǎng)量。根據(jù)菌體量以確定該菌株在不同條件下的生長(zhǎng)狀況。

1.5 菌株發(fā)酵及酶液制備

分離、篩選獲得的菌株在500 mL三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)，初始裝液量為100 mL，初始pH7.0，溫度50℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵36 h。發(fā)酵結(jié)束后，8000×g下離心10 min，對(duì)上清液進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。將該菌株所產(chǎn)的β-甘露聚糖酶命名為BS-Man。

1.6 甘露聚糖酶活力測(cè)定

1.6.1 測(cè)定方法 采用DNS法檢測(cè)β-甘露聚糖酶酶活。用0.1 mol/L、pH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋酶液及配制反應(yīng)底物（6 g/L槐豆膠），吸取2.0 mL經(jīng)37℃預(yù)熱的待測(cè)酶液至試管中，加入2.0 mL經(jīng)37℃預(yù)熱的底物溶液，振蕩，37℃精確水浴30 min，然后加入5.0 mL DNS試劑，振蕩混勻，以終止酶解反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)體系在沸水中加熱5 min后，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25.0 mL，振蕩混勻。以標(biāo)準(zhǔn)空白樣作為空白對(duì)照，測(cè)定D540nm值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相應(yīng)的酶活。1.6.2 酶活定義 在37℃、pH5.5的條件下，每分鐘從3 mg/mL甘露聚糖溶液中水解釋放1 μmol還原糖所需酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

1.7 BS-Man的最適反應(yīng)pH值

分別添加等量的BS-Man酶液，在37℃、不同pH值（1.5～10）條件下反應(yīng)30 min（pH1.5～5.0：磷酸氫二鈉-鹽酸緩沖液；pH5.0～8.5：磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液；pH8.5～10.0：甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液），測(cè)定不同pH值下的酶活性，以所測(cè)得最高酶活性為100%，其余不同pH值條件下所測(cè)酶活力與之相比，得到該酶在不同pH值下的相對(duì)酶活，從而確定其最適pH值。

1.8 BS-Man的最適反應(yīng)溫度及耐熱性能測(cè)試

在最適pH值條件下，于不同溫度（30～80℃）反應(yīng)30 min，設(shè)定最高酶活為100%，其余反應(yīng)溫度下所測(cè)出的酶活力與之相對(duì)比，獲得各反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活，以確定該酶的最適反應(yīng)溫度。

另外，為確定該酶的耐高溫性能，在相同條件下，各組取等量酶液在不同溫度（60～90℃）預(yù)處理不同時(shí)間，以未經(jīng)熱處理的酶液酶活力為100%，各處理組與之相比，獲得該酶經(jīng)不同溫度處理后的剩余相對(duì)酶活，確定其耐高溫性能。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶的菌株篩選

對(duì)富集培養(yǎng)后的培養(yǎng)產(chǎn)物，采用添加魔芋精粉及剛果紅的LB固體篩選培養(yǎng)基進(jìn)行菌種篩選，結(jié)果如圖1，在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的菌落呈白色，表面粗糙不規(guī)則，有隆起、皺褶。所挑選菌落的水解透明圈與菌落大小見表1，根據(jù)H/C比值，選取2號(hào)菌落進(jìn)行后續(xù)鑒定，并將該菌株命名為TBS2。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 TBS2在電鏡下的形態(tài)見圖2，該菌呈桿狀，可見內(nèi)生孢子，無莢膜，長(zhǎng)有鞭毛，符合芽孢桿菌的形態(tài)特征。

2.2.2 生理生化鑒定 TBS2的生理生化測(cè)試結(jié)果見表2，參照鑒定手冊(cè)，可以初步判定TBS2為芽胞桿菌屬菌株。

圖1 產(chǎn)β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株篩選

圖2 TBS2在電鏡下的形態(tài)（10 000×）

表1 各菌落水解透明圈與菌落直徑

2.2.3 16S rDNA鑒定 以提取的TBS2基因組DNA為模板、27F和1492R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲

得一條約1.5 kb的條帶（圖3），測(cè)序結(jié)果表明該序列總長(zhǎng)為1503 bp。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相似序列，采用MEGA5.2構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4?？梢钥闯?，TBS2與枯草芽孢桿菌位于同一分支，同源性最高，達(dá)到99%。因此，結(jié)合以上菌體形態(tài)、生理生化特征，可以確定我們從熱泉中分離、篩選獲得的微生物為一種嗜熱枯草芽孢桿菌。

2.3 TBS2在不同溫度及pH值條件下的生長(zhǎng)性能

圖3 TBS2的16S rDNA PCR產(chǎn)物分析M：DNA marker；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 TBS2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

表2 TBS2生理生化特征

將篩選出的嗜熱枯草芽胞桿菌TBS2，在不同溫度及pH值條件下，于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)培養(yǎng)。結(jié)果表明，TBS2可在35～80℃下生長(zhǎng)，溫度低于35℃及高于85℃時(shí)均不生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為50℃。此外，該菌株可在pH4.0～9.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH值為6.0～7.0，該結(jié)果與段蕾等報(bào)道的枯草芽孢桿菌CD-3一致[14]。

2.4 BS-Man的最適pH值測(cè)定

由TBS2所產(chǎn)β-甘露聚糖酶BS-Man的反應(yīng)pH值曲線（圖5）可以看出，BS-Man的最適反應(yīng)pH值為6.0。

2.5 BS-Man的最適反應(yīng)溫度及耐熱性能

由BS-Man的反應(yīng)溫度曲線（圖6）可以看出，BS-Man的最適反應(yīng)溫度為55℃。

BS-Man的耐熱性能曲線如圖7，在60～70℃處理不超過60 min時(shí)，酶活損失量很小，但隨著處理溫度及時(shí)間的增加，酶活損失加劇，但即使這樣，該酶在 90℃處理 10 min，剩余酶活仍達(dá)63.6%，這表明我們篩選出的菌株所產(chǎn)β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能。

3 討論

圖5 BS-Man的反應(yīng)pH值曲線

圖6 BS-Man的反應(yīng)溫度曲線

圖7 BS-Man在不同溫度下的耐熱性能

β-甘露聚糖酶應(yīng)用廣泛，但在很多領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用時(shí)須具有良好的耐高溫能力。如飼料制粒時(shí)，通常要求在85℃以上處理3 min左右，一般的酶在這種條件下極易完全變性，從而失去效果。因此，作為一種合格的飼料用酶，要求所開發(fā)的β-甘露聚糖酶至少能耐受85℃以上的高溫。

目前已開發(fā)出的β-甘露聚糖酶的耐高溫性能普遍不高，難以滿足現(xiàn)有工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求，因此，開發(fā)出一種具有優(yōu)良耐高溫性能的β-甘露聚糖酶具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

為提高β-甘露聚糖酶的耐高溫性能，有人嘗試過采用定點(diǎn)突變、添加保護(hù)劑或在酶蛋白表面進(jìn)行物理包被等方法，以改變酶蛋白的空間結(jié)構(gòu)，或避免酶蛋白與熱氣直接接觸來提高其耐高溫性能[15-16]，但所取得的效果并不理想。

極端環(huán)境下生長(zhǎng)的微生物，如極端嗜熱、極端嗜鹽等微生物，往往有極強(qiáng)的耐受能力，具有優(yōu)異而特殊的基因資源。因此，這些微生物成為目前生物資源開發(fā)的一大寶庫。至2001年，已有60多種極端微生物被發(fā)現(xiàn)并利用[17]。通常，極端嗜熱的微生物所產(chǎn)生的酶往往具有極高的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性和耐受化學(xué)或物理變性劑的優(yōu)良特性，如耐高溫α-淀粉酶、DNA聚合酶等的開發(fā)即是非常有代表性的例子。因此，從環(huán)境中直接篩選極端嗜熱微生物，通過分子生物學(xué)技術(shù)克隆相關(guān)基因，進(jìn)一步進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化、改造，并選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)，是耐高溫酶制劑開發(fā)的一個(gè)發(fā)展方向，更具有可行性和可操作性，可產(chǎn)生巨大的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用價(jià)值。

在本研究中，我們從熱泉中分離、篩選出一株極端嗜熱的枯草芽孢桿菌TBS2，該菌所產(chǎn)的耐高溫β-甘露聚糖酶具有良好的耐高溫性能，這為我們后續(xù)的重組耐高溫β-甘露聚糖酶的開發(fā)及應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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