重金屬鎘通過DNA氧化損傷途徑誘導(dǎo)細(xì)胞中心體擴(kuò)增

張瑞凱，張艷花，劉琴琴，楊華麗，李少欽

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

隨著工業(yè)化和城市化的發(fā)展，重金屬污染因其高毒性、普遍性和持久性的存在，成為影響生態(tài)系統(tǒng)中有機(jī)體代謝的重要環(huán)境問題[1]。通常密度超過5 g/cm3的金屬被稱為重金屬，其中鉛（Pb）、鎘（Cd）、汞（Hg）、鉻（Cr）和砷（As）廣泛存在于環(huán)境中，是威脅人體健康的主要的有毒重金屬[1]。鎘是天然存在的重金屬之一，在工業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常使用，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）歸為Ⅰ類致癌物[2-4]。鎘暴露的主要來源是食品、香煙煙霧及鎘相關(guān)工業(yè)。鎘具有很長的生物半衰期，容易導(dǎo)致毒性累積，產(chǎn)生致癌作用[5]。

癌癥是最常見的無傳染性疾病，其致死率處于領(lǐng)先地位。根據(jù)2017年2月世界衛(wèi)生組織（WHO）更新的數(shù)據(jù)，2012年約有1400萬新增癌癥病例，2015年約有880萬的死亡病例和癌癥有關(guān)。已明確，長期暴露在鎘環(huán)境下會增加癌癥的發(fā)生率[6-7]，但鎘導(dǎo)致癌癥的機(jī)制尚不清楚[8-9]。中心體擴(kuò)增指的是在一個細(xì)胞中出現(xiàn)超過2個中心體。已有報道稱中心體擴(kuò)增在癌癥發(fā)生過程中扮演重要角色[10-13]，中心體擴(kuò)增能把非腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞[10]，轉(zhuǎn)基因誘發(fā)中心體擴(kuò)增的小鼠會自發(fā)產(chǎn)生腫瘤[14]。有研究證明重金屬也會引起中心體擴(kuò)增[15]。目前還不清楚鎘是否會引起中心體擴(kuò)增，如是，那么中心體擴(kuò)增就可能是鎘誘發(fā)腫瘤的生物學(xué)機(jī)理。

許多研究發(fā)現(xiàn)，重金屬鎘能夠引發(fā)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生[4,16-21]和細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷[22]。但是，并不清楚鎘是否通過升高ROS而引起DNA的氧化損傷。由于ROS和DNA損傷都與中心體擴(kuò)增有關(guān)[23]，我們假設(shè)鎘通過DNA氧化損傷途徑誘發(fā)中心體擴(kuò)增，并通過本研究驗(yàn)證這個假說，研究內(nèi)容包括鎘是否能誘發(fā)中心體擴(kuò)增，以及鎘是否通過誘發(fā)DNA氧化損傷而導(dǎo)致中心體擴(kuò)增。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116為本實(shí)驗(yàn)室保存，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清、1%雙抗（青、鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，直到細(xì)胞貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞密度長至70%左右，細(xì)胞狀態(tài)良好時即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

DMEM培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；活性氧檢測試劑盒夠自碧云天生物技術(shù)公司；彗星電泳試劑盒夠自TER?VIGEN公司；抗體及其他試劑購自Sigma公司。

1.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性

收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，在96孔板中每孔接種約5×103個，設(shè)置3個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后用不同濃度的CdCl2處理48 h，對照組加入等量的ddH2O；CdCl2處理結(jié)束后每孔加入15 μL MTT試劑（5 mg/mL），在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；棄掉每孔的培養(yǎng)基，加入 150 μL二甲基亞砜（DMSO），輕輕振蕩混勻10 min使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測定每孔的D490nm值，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.3 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

在6孔板的每孔各放入2～3個蓋玻片，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以5×103/孔的密度接種；爬片后的細(xì)胞用甲醛丙酮體積比為1∶1的混合液在-20℃冰箱中固定6 min；用PBS洗3次（每次10 min）；細(xì)胞在0.1%Triton X-100和3%牛血清白蛋白（BSA）（PBS配制）中分別孵育15 min和1 h；細(xì)胞在用3%BSA稀釋的一抗中孵育過夜，4℃下用PBS洗3次（每次10 min）；細(xì)胞在用3% BSA稀釋的二抗中室溫避光孵育1 h；用PBS洗3次（每次10 min）；用DAPI染細(xì)胞，封片；在熒光顯微鏡下用油鏡觀察每個細(xì)胞的中心體數(shù)目。

1.4 ROS檢測

用ROS檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)ROS變化。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2.5×104/孔的密度鋪24孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后CdCl2處理2 h；去除培養(yǎng)液，加入500 μL熒光探針DCFH-DA，培養(yǎng)箱中孵育20 min后用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次；收集細(xì)胞，用PBS重懸，均勻離心，重復(fù)2次后用1 mL PBS重懸均勻；各吸200 μL于96孔板中，熒光酶標(biāo)儀檢測488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長處的熒光值，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.5 彗星電泳實(shí)驗(yàn)

裂解液在4℃預(yù)冷至少20 min；將低熔點(diǎn)瓊脂糖放在沸水中直到融化并保持5 min；將融化的瓊脂糖在37℃水浴中冷卻20 min；將細(xì)胞與融化的瓊脂糖（37℃）按體積比1∶10的比例混勻，并迅速滴50 μL到彗星玻璃片上；將玻片放入4℃黑暗保持10 min，使瓊脂糖充分凝固；將玻片浸沒在預(yù)冷的裂解液中30～60 min；將玻片浸沒在堿性解旋液中，室溫避光保持20 min或4℃保持1 h；電泳槽中加入4℃預(yù)冷的堿性電泳液，將玻片浸沒在電泳液中，20 V電壓下電泳30 min；將玻片用ddH2O輕輕沖洗2次，然后在70%的酒精中浸泡5 min，在37℃下將玻片干燥15 min；EB染料染片后在熒光顯微鏡下觀察，DNA在紫外光激發(fā)下會放射出橙紅色信號。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性，采用單因素方差分析分析各組間差異的顯著性，結(jié)果以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 CdCl2對HCT116細(xì)胞活性的影響

用不同濃度的CdCl2（0、10、20、40 μmol/L）處理HCT116細(xì)胞48 h，如圖1所示，隨著CdCl2濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸降低（P＜0.01），呈劑量依賴效應(yīng)。重要的是，20 μmol/L以下濃度的CdCl2對細(xì)胞活性幾乎沒有影響。

圖1 CdCl2對HCT116細(xì)胞活性的影響**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

2.2 CdCl2引起HCT116細(xì)胞中心體擴(kuò)增

20 μmol/L及以下濃度的CdCl2對細(xì)胞活性沒有明顯的抑制作用。用20 μmol/L或以下濃度的CdCl2處理細(xì)胞，免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察和計數(shù)中心體，細(xì)胞核由DAPI染色，呈現(xiàn)藍(lán)色，中心體呈現(xiàn)綠色，實(shí)驗(yàn)處理誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生中心體擴(kuò)增，出現(xiàn)3個或以上的中心體形態(tài)（圖2）。鎘誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（P＜0.01）（圖3）。

圖2 CdCl2處理后免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞中心體藍(lán)色熒光示細(xì)胞核，綠色熒光示中心體，箭頭指向擴(kuò)增的中心體

2.3 CdCl2引起細(xì)胞內(nèi)ROS升高

用無毒劑量的CdCl2（20 μmol/L）處理細(xì)胞2 h，檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，設(shè)置對照組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）組、CdCl2組、CdCl2+NAC組。結(jié)果如圖4，CdCl2處理組的ROS水平明顯高于對照組（P＜0.01）；當(dāng)同時有抗氧化劑NAC（提前1 h加）存在時，CdCl2升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平的活性被抑制（P＜0.01）。

2.4 CdCl2引起細(xì)胞DNA損傷

用無毒劑量的CdCl2（20 μmol/L）處理細(xì)胞，彗星電泳實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的DNA損傷水平，結(jié)果如圖5，橙紅色示DNA，CdCl2處理后的細(xì)胞核出現(xiàn)彗星狀拖尾現(xiàn)象，彗星數(shù)量與對照組相比明顯升高（P＜0.01）；當(dāng)加入抗氧化劑NAC后，鎘誘導(dǎo)產(chǎn)生彗星的能力受到抑制（P＜0.01）（圖6）。

圖3 CdCl2處理后HCT116細(xì)胞中心體的擴(kuò)增率**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

圖4 CdCl2處理對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

圖5 彗星電泳圖像

圖6 CdCl2處理細(xì)胞引起DNA斷裂**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

2.5 NAC降低CdCl2引起的中心體擴(kuò)增率

用無毒劑量的CdCl2（20 μmol/L）處理細(xì)胞后，細(xì)胞中心體擴(kuò)增率明顯升高（P＜0.01），而當(dāng)加入NAC（提前1 h加）后，CdCl2誘導(dǎo)的中心體擴(kuò)增明顯受到抑制（P＜0.01）（圖7）。

圖7 NAC對CdCl2處理誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增的影響**：與對照組相比P＜0.01，差異極顯著

3 討論

中心體擴(kuò)增的機(jī)制比較復(fù)雜，幾種潛在機(jī)制已被提出[11]：①在一個細(xì)胞周期中出現(xiàn)多次中心體的擴(kuò)增；②胞質(zhì)分裂失敗，導(dǎo)致基因組及中心體數(shù)目增加1倍；③中心粒不受控制的分裂。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)越來越多的蛋白可能與之有關(guān)：腫瘤抑制因子p53在調(diào)控G1-S和G2-M檢驗(yàn)點(diǎn)方面起著較為重要的作用，它的失活可導(dǎo)致中心體周期的失常[24]；人乳頭瘤病毒（HPV）E6和E7蛋白可能通過作用于不同的通路來阻礙中心體的自身平衡，E6可能通過使p53功能失活起作用，而E7可能通過滅活Rb導(dǎo)致中心體擴(kuò)增[25]。Hol?mes等[15]報道稱重金屬能夠誘導(dǎo)中心體發(fā)生擴(kuò)增，并且目前只有4種重金屬表現(xiàn)出誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增的能力，包括砷、六價鉻、汞和納米鈦顆粒，每種金屬通過不同的機(jī)制誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增。重金屬誘導(dǎo)的中心體擴(kuò)增及其在致癌性和細(xì)胞毒性中的作用尚未見研究報道。我們的實(shí)驗(yàn)表明，在低濃度的對細(xì)胞活性沒有明顯抑制的無毒性劑量下，鎘會誘發(fā)明顯的中心體擴(kuò)增現(xiàn)象，這進(jìn)一步證實(shí)了我們最近的報道[26]。

ROS在包括癌癥在內(nèi)的各種人類疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。已有報道[1,12]表明鉛、鎘、汞、鉻和砷等重金屬是ROS的常見外源誘導(dǎo)物，可直接或間接誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生。Son等[5]研究發(fā)現(xiàn)ROS直接參與了鎘誘導(dǎo)的癌變過程，并且提示AKT/ GSK-3β/β-catenin信號通路在此過程中的作用。我們的研究同樣表明暴露在低濃度重金屬鎘下，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平急劇增加，而當(dāng)加入抗氧化劑NAC之后，ROS水平會明顯下降。

Filipic等[27]的研究表明，即使在低濃度的情況下，鎘也能通過誘導(dǎo)DNA損傷和抑制DNA損傷修復(fù)來誘導(dǎo)突變。Yuan等[1]同樣闡明重金屬直接或間接誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生并導(dǎo)致胃癌黏膜和DNA損傷，隨后改變基因調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生長，最終導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。Skipper等[2]采用彗星電泳檢測到CdCl2能以濃度依賴的方式造成肝癌細(xì)胞HepG2的DNA損傷。我們的實(shí)驗(yàn)表明在低濃度鎘處理下，ROS和DNA斷裂水平都升高，加入抗氧化劑NAC后細(xì)胞內(nèi)的ROS水平受到抑制，DNA損傷水平明顯降低。這提示鎘可以誘發(fā)DNA的氧化損傷。

我們的實(shí)驗(yàn)表明低濃度無毒劑量的鎘處理會誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)中心體的擴(kuò)增，同時會造成細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高和DNA水平的損傷。因此，我們想探討ROS和DNA損傷在鎘誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增的過程中扮演什么角色。當(dāng)加入抗氧化劑NAC后，ROS水平和DNA損傷水平均明顯下降，并且對鎘誘導(dǎo)的中心體擴(kuò)增有明顯的抑制。這提示鎘通過DNA氧化損傷途徑來誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增。

總之，以上研究結(jié)果提示鎘通過DNA氧化損傷途徑誘導(dǎo)中心體擴(kuò)增。因?yàn)橹行捏w擴(kuò)增能使非腫瘤細(xì)胞演變?yōu)槟[瘤細(xì)胞，所以中心體擴(kuò)增可能是鎘致癌的生物學(xué)機(jī)理。

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