寨卡病毒囊膜E蛋白的原核表達(dá)及其抗體制備

王佳美，鞏新，劉黨生，吳軍，劉波

1.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；

2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）屬于黃病毒科黃病毒屬，黃病毒家族成員還包括黃熱病毒（YFV）、登革熱病毒（DENV）、日本乙型腦炎病毒（JEV）、西尼羅病毒（WNV）、蜱傳腦炎病毒（TBEV）等[1]。只有約20%寨卡病毒感染者會(huì)出現(xiàn)輕微癥狀，2～7 d可自愈。但如果孕婦感染了寨卡病毒，病毒會(huì)通過胎盤屏障感染胎兒，病情較為嚴(yán)重，導(dǎo)致新生兒小頭癥[2]和格林-巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）[3]。世界衛(wèi)生組織（WHO）曾在2016年2月宣布將寨卡病毒列為全球公共衛(wèi)生緊急事件。

寨卡病毒只有一種血清型，電鏡下形態(tài)呈球形顆粒，有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約10.8 kb，兩端是非編碼區(qū)，中間有一段開放讀框，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白C、前體膜蛋白PrM、囊膜蛋白E）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[4]，結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒顆粒的各個(gè)結(jié)構(gòu)，非結(jié)構(gòu)蛋白參與基因組復(fù)制和功能性多聚蛋白的合成。當(dāng)寨卡病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)，在低pH值環(huán)境下，病毒包膜E蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)病毒粒子與細(xì)胞膜融合，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（RMF）釋放寨卡病毒本身的核酸到宿主細(xì)胞，囊膜（envelope，E）蛋白能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性抗體，前體膜（Premembrane，PrM）蛋白在E蛋白構(gòu)象的正確折疊和病毒出胞過程中起重要作用，因此目前這2種蛋白常作為黃病毒疫苗設(shè)計(jì)和研發(fā)的首選[5]。我們前期以實(shí)驗(yàn)室糖基工程酵母平臺(tái)為基礎(chǔ)，開展了糖基工程酵母制備寨卡病毒E蛋白亞單位疫苗的研究，結(jié)果表明商業(yè)化寨卡病毒E蛋白抗體效價(jià)較低，特異性較差，檢測(cè)結(jié)果不理想。因此，在本研究中，我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取了E蛋白抗原表位較集中的200個(gè)氨基酸片段（138～338）作為目的片段（圖1）[6]，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白，以該蛋白為抗原免疫小鼠，獲得了針對(duì)寨卡病毒E蛋白的特異性多克隆抗體，為后續(xù)開展寨卡病毒E蛋白亞單位疫苗的研究提供檢測(cè)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡BALB/c雌鼠由維通利華公司提供；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，Q5熱啟動(dòng)高保真DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒pET22b由本室保存；DNA提取試劑盒及瓊脂糖凝膠基因片段回收試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司。

LB/Amp培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L氯化鈉，100 mg/L氨芐青霉素。

Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基：20 g/L酵母抽提物，10 g/L胰蛋白胨，PB緩沖液（pH7.0）濃度為50 mmol/L。

1.2 目的基因的獲取

從NCBI網(wǎng)站獲取寨卡病毒E蛋白全基因序列（GenBank：KU312315.1），由上海生工生物工程有限公司合成該基因。以合成的基因?yàn)槟０澹鶕?jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取抗原表位較集中的200個(gè)氨基酸（138～338）作為插入片段，設(shè)計(jì)引物ZIKVE5（5'-GCTCTTAAGATGAGAATCATGTTGTCCGTTCAT-3',下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）和ZIKVE3（5'-GTCGAGCTCACCACCACCACCACCGTCAGTACCAG CGTATTGAAC-3'，下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn)），PCR擴(kuò)增ZIKV-E200基因片段，用DNA片段回收試劑盒回收PCR片段。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

質(zhì)粒pET22b和回收的片段用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切，DNA回收試劑盒分別回收載體和片段，用T4DNA連接酶連接回收后的載體和片段，將連接后的重組載體熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。

圖1 寨卡病毒E蛋白

1.4 重組載體在原核細(xì)胞中的表達(dá)

將測(cè)序正確的單克隆進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增，在5 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)15 h，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組表達(dá)質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于5 mL LB/Amp液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)15 h，按10%的接種量接到200 mLⅠ號(hào)培養(yǎng)基中，待菌密度（D600nm值）為0.6時(shí)，用IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)8 h。用同樣方法培養(yǎng)和誘導(dǎo)大腸桿菌BL21（DE3）作為陰性對(duì)照。

1.5 目的蛋白的分離

回收重組表達(dá)菌體和對(duì)照菌體，超聲波破碎，破碎后的對(duì)照菌體于-20℃保存?zhèn)溆?。破碎后的重組菌體于12 000 r/min離心10 min，沉淀用2 mol/L尿素溶解2 h，12 000 r/min離心10 min，將上清液和沉淀分開，分別用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，用6 mol/L尿素繼續(xù)溶解沉淀2 h，12 000 r/min離心10 min，上清和沉淀用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析，將表達(dá)的目的蛋白切膠回收，用研缽研細(xì)至1 mL注射器可抽吸，用少量生理鹽水重懸，加入等量的弗氏佐劑，冰浴超聲波混勻。

1.6 抗寨卡病毒E蛋白多克隆抗體的制備

將制備好的抗原皮下注射BALB/c小鼠，21 d后進(jìn)行第2次免疫，再21 d后進(jìn)行第3次免疫，14 d后每只小鼠眼眶取血約600 μL，12 000 r/ min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western印跡檢測(cè)血清中多克隆抗體的特異性

用糖基工程酵母表達(dá)的帶有His-tag標(biāo)簽的寨卡病毒E全長(zhǎng)重組蛋白檢測(cè)多克隆抗體的特異性。將表達(dá)寨卡病毒E蛋白的酵母菌裂解液和空白酵母菌裂解液分別用15%的SDS-PAGE分離，半干法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上（15 V，20 min），用5%脫脂奶粉封閉1 h，以收集的鼠血清為一抗（稀釋度1∶3000）孵育1 h，以辣根過氧化酶（HRP）標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗（稀釋度1∶10 000）孵育1 h，對(duì)照組用抗His-tag抗體孵育，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲取

按照方法1.1所述，以ZIKVE5和ZIKVE3為引物，PCR擴(kuò)增出約600 bp的目的片段（圖2），用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切，克隆到載體pET22b相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上（圖3），構(gòu)建成pET22b-ZIKV-E200重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆（圖4），測(cè)序結(jié)果顯示插入表達(dá)載體pET22b-ZIKV-E200的ZIKV-E200編碼基因序列完全正確。

2.2 重組載體在原核細(xì)胞中的表達(dá)

圖2 ZIKV-E200基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜M：Trans 2K plusⅡDNA marker；1：ZIKV-E200基因（600 bp）

圖3 pET22b-ZIKV-E200表達(dá)質(zhì)粒

圖4 菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆M：Trans 2K plusⅡDNA marker；1～5：陽(yáng)性克隆

回收的菌液12 000 r/min離心5 min后，吸除培養(yǎng)上清，濕菌稱重，按重量比1∶100加水重懸菌體，超聲波破碎菌體，12 000 r/min離心15 min，沉淀按原濕菌重加水重懸，用15%SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的條帶相對(duì)分子質(zhì)量約為25 000，與理論值一致，并且目的蛋白以包涵體形式存在于破菌沉淀中（圖5）。破碎后的離心沉淀用2 mol/ L尿素溶解，溶解后的上清液和沉淀分別用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖6），用6 mol/L尿素繼續(xù)溶解沉淀，溶解后的上清液和沉淀分別用15%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖7），表達(dá)蛋白大部分存在6 mol/L尿素溶解上清中。

2.3 Western印跡檢測(cè)血清中的多克隆抗體

圖5 重組菌表達(dá)的SDS-PAGE圖譜M：Blue plusⅡprotein王佳美、marker；1：菌液離心沉淀；2：菌液離心上清

圖6 2 mol/L尿素溶解后SDS-PAGE圖譜M：Blue plusⅡprotein王佳美、 marker；1：2 mol/L尿素溶解后離心沉淀；2：2 mol/L尿素溶解后離心上清

圖7 6 mol/L尿素溶解后SDS-PAGE圖譜M：Blue plusⅡprotein王佳美、 marker；1：6 mol/L尿素溶解后離心上清；2：6 mol/L尿素溶解后離心沉淀

利用3次免疫后獲得的鼠血清為一抗、HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western印跡，檢測(cè)該血清中多克隆抗體的特異性，用抗His-tag抗體作為對(duì)照，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室利用糖基工程酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白的全長(zhǎng)片段。結(jié)果在相對(duì)分子質(zhì)量50 000～60 000處出現(xiàn)了特異性條帶，與理論值（54 000）接近，而在空白酵母菌裂解液中沒有檢測(cè)到特異性條帶，與抗His-tag抗體檢測(cè)結(jié)果一致（圖8）。

3 討論

我們利用大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)了ZIKVE200蛋白，免疫小鼠后獲得的多克隆抗體檢測(cè)到了酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白，蛋白大小與抗His-tag抗體檢測(cè)結(jié)果一致，表明該多克隆抗體可用于酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白的檢測(cè)等研究。

近年來寨卡病毒疫情迅速蔓延，已成為威脅全球人類健康的潛在因素，目前尚無針對(duì)性的特效藥和預(yù)防性疫苗，因此對(duì)于寨卡病毒致病機(jī)制、免疫策略、治療手段的研究已經(jīng)是當(dāng)務(wù)之急。在前期研究中，我們用糖基工程酵母表達(dá)了寨卡病毒E蛋白，因?yàn)樯虡I(yè)化寨卡病毒E蛋白抗體，靈敏度不夠，難以檢測(cè)寨卡病毒E蛋白基因在工程酵母中的表達(dá)情況，所以本研究的目的是獲得寨卡病毒E蛋白的檢測(cè)抗體。為提高表達(dá)效率，我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取E蛋白抗原表位較集中的200個(gè)氨基酸片段作為目的片段[6]，利用大腸桿菌培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、表達(dá)產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)了ZIKV-E200重組蛋白截短片段。可能由于蛋白自身疏水性較高，蛋白是以包涵體形式表達(dá)的，包涵體須經(jīng)過復(fù)雜的溶解、復(fù)性、純化才能獲得有活性的蛋白，因此采用尿素溶解、切膠回收目的蛋白的方法制備免疫抗原，免疫BALB/c小鼠后獲得了多克隆抗體，針對(duì)酵母表達(dá)的寨卡病毒E蛋白特異性較高，為寨卡病毒亞單位疫苗后續(xù)研究提供了檢測(cè)抗體。

圖8 抗ZIKV-E200多克隆抗體的Western印跡M：EasySeeⅡWestern marker；1：ZIKV E蛋白以抗His-tag抗體為一抗；2：空白菌（裂解液）以抗His-tag抗體為一抗；3：ZIKV E蛋白以抗ZIKV-E200血清為一抗；4：空白菌（裂解液）以抗ZIKV-E200血清為一抗

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