• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    食甲基桿菌J1-1吡咯喹啉醌生物合成突變株的篩選和鑒定

    2018-04-09 03:37:20李彤景愛霞楊亞欣劉曉陽汪建華劉黨生熊向華張惟材
    生物技術(shù)通訊 2018年2期
    關(guān)鍵詞:發(fā)酵液碳源抗性

    李彤,景愛霞,楊亞欣,劉曉陽,汪建華,劉黨生,熊向華,張惟材

    1.沈陽藥科大學,遼寧 沈陽 110016;2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院,北京 100071

    吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)是20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)的繼煙酰胺核苷酸和黃素核苷酸后第三類氧化還原酶的輔酶[1],具有抗氧化、清除氧自由基、增強線粒體功能、保護心肌損傷、促進認知等多種生理功能[2-4]。PQQ的制備方法主要有化學合成法和生物合成法?;瘜W合成步驟多、成本高、易造成環(huán)境污染,而生物合成周期短、成本低,被認為是最有前景的工業(yè)化生產(chǎn)路線。迄今發(fā)現(xiàn)只有某些革蘭陰性菌能產(chǎn)生PQQ,如乙酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯菌、扭脫甲基桿菌、氧化葡糖桿菌等[5]。目前PQQ合成基因以及PQQ的生物合成途徑還不完全清楚。從革蘭陰性菌分離到的PQQ合成基因包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF、pqqG,大多以基因簇的形式存在。其中pqqA基因編碼的小肽PqqA含有PQQ生物合成的骨架物質(zhì)谷氨酸和酪氨酸,被認為是PQQ合成的前體;PqqB可能與PQQ的跨膜運輸有關(guān);PqqC負責催化PQQ合成最后一步反應;PqqD的功能尚不清楚;PqqE的作用可能是連接前體中的谷氨酸和酪氨酸殘基;PqqF、PqqG在PQQ合成中可能發(fā)揮內(nèi)切酶的作用[6]。

    本實驗室從土壤中分離篩選到一株P(guān)QQ產(chǎn)生菌MP688,后經(jīng)誘變得到高產(chǎn)菌株J1-1。已完成MP688的全基因組測序,發(fā)現(xiàn)其中PQQ合成基因包括基因簇pqqABCDE和pqqFG,以及4個單獨拷貝的pqqA基因[7]。在此,我們通過Tn5轉(zhuǎn)座誘變技術(shù)進一步篩選食甲基桿菌J1-1中參與PQQ生物合成的相關(guān)基因,為闡明PQQ的生物合成機制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    食甲基桿菌J1-1、大腸桿菌λ-pir感受態(tài)細胞、質(zhì)粒pCM66和pGX由本實驗室保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、快速質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;ENTn5<R6Kγori/KAN-2>TNP Transposome Kit購自Epicentre公司;限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司;DNA聚合酶、pEASY-Uni SeamLess Cloning and Assembly Kit、T4DNA連接酶、DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;PCR引物(表1)合成及測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

    LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,121℃滅菌20 min。

    HC培養(yǎng)基:MgSO4·7H2O 0.2 g/L,KH2PO42.8 g/L,(NH4)2SO43.0 g/L,Na2HPO46.0 g/L,MnCl2· 4H2O 5.0 mg/L,ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L,CuSO4· 5H2O 0.5 mg/L,檸檬酸鐵60.0 mg/L,甲醇10 mL/ L,pH7.0,115℃滅菌30 min。

    1.2 分子生物學操作

    PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學操作參照文獻方法進行[8]。

    1.3 Tn5突變體庫的構(gòu)建

    從 EN-Tn5<R6Kγori/KAN-2>TNP Transpo?some Kit中取1 μL Transposome加入J1-1感受態(tài)細胞中,冰浴5 min混勻后轉(zhuǎn)移到預冷的電擊杯中,2.5 kV電擊后迅速加入500 μL HC培養(yǎng)基,30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4 h,涂布于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)的HC平板上,倒置培養(yǎng)2~3 d。挑取單菌落于5 mL HC Kan抗性試管中,30℃、200 r/min培養(yǎng)4 d,連續(xù)傳3代后仍有Kan抗性,說明轉(zhuǎn)座序列可以穩(wěn)定傳代,以此方法建立突變體庫。

    表1 PCR引物序列

    1.4 PQQ合成缺陷突變株的篩選及PQQ合成水平檢測

    PQQ是一種棕紅色小分子化合物,食甲基桿菌J1-1在發(fā)酵過程中,PQQ被逐漸分泌到胞外,使發(fā)酵液呈紅色,發(fā)酵液顏色可直觀反映PQQ合成水平。挑取Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫上的單菌落于5 mL HC液體培養(yǎng)基中,以J1-1為對照,30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,挑選發(fā)酵液顏色呈白色且與對照菌發(fā)酵液顏色差異較大的菌株作為初篩突變株,進一步采用分光光度法[9]檢測發(fā)酵液中PQQ合成水平。

    1.5 質(zhì)粒拯救法鑒定插入位點

    突變菌株基因組提取按照基因組提取試劑盒說明書進行。選擇適當限制性內(nèi)切酶單酶切突變株基因組,酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接,熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌λ-pir感受態(tài)細胞中,涂布于含50 μg/mL Kan的LB抗性平板上,挑取單菌落37℃振蕩培養(yǎng),12 h后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒,由華大公司用引物SeFP/SeRP測序,測序結(jié)果通過NCBI的BLAST比對,確定Tn5插入位點。

    1.6 mpq0056基因敲除

    以J1-1基因組為模板,選用引物up1500-F/ up1500-R和down1500-F/down1500-R分別擴增上、下游同源臂基因;以質(zhì)粒pGX-Gm為模板,選用引物Gm-F/Gm-R擴增慶大霉素(Gm)基因片段,擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用膠回收試劑盒純化。將上、下游同源臂基因,Gm基因和經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ雙酶切的載體pGX-Gm用pEASYUni SeamLess Cloning and Assembly Kit重組轉(zhuǎn)化,獲得pGX-up-Gm-down重組質(zhì)粒。

    以pGX-up-Gm-down質(zhì)粒為模板,選用引物up1500-F/down1500-R擴增片段-up-Gm-down-,純化后電擊轉(zhuǎn)入J1-1感受態(tài)細胞,從HC抗性平板上挑取單菌落,通過組合PCR驗證敲除菌。

    1.7 mpq0056基因回補及過表達

    用啟動子預測軟件BPROM預測mpq0056基因的啟動子位置。以J1-1基因組為模板,用引物mpq0056-F/mpq0056-R擴增mpq0056啟動子及編碼基因,回收純化DNA,用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ分別雙酶切載體pCM66及目的DNA并膠回收純化,酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接,將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆,提取質(zhì)粒酶切驗證。

    將質(zhì)粒pCM66-0056分別電擊轉(zhuǎn)化野生菌J1-1和敲除菌J1-1Δ0056,構(gòu)建過表達菌株和回補菌株。HC抗性平板培養(yǎng)2~3 d后,挑取單克隆于HC液體培養(yǎng)基中,提取質(zhì)粒復轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中,測序鑒定。

    1.8 菌株生長評價

    挑取野生菌J1-1、突變菌1-52、敲除菌J1-1Δ 0056、回補菌和過表達菌單菌落于5 mL HC液體培養(yǎng)基中,30℃活化24 h,分別按1%的接種量接種至100 mL HC液體培養(yǎng)基中,30℃同步培養(yǎng),間隔12 h取樣測定D600nm值,繪制生長曲線。

    2 結(jié)果

    2.1 Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫構(gòu)建

    對J1-1進行Tn5轉(zhuǎn)座誘變,通過Kan抗性篩選,構(gòu)建得到庫容量為1.0×105的突變體庫。以突變株基因組為模板,用引物Kan-F/R、MOD-F/R PCR擴增Kan與轉(zhuǎn)座序列,分別獲得約800和1923 bp的特異性條帶,與預期相符(圖1),表明轉(zhuǎn)座序列已插入受體菌株染色體基因組。

    2.2 Tn5轉(zhuǎn)座突變株的篩選和插入位點鑒定

    經(jīng)Tn5突變體庫篩選獲得1株P(guān)QQ產(chǎn)量顯著降低的突變株1-52,該突變株發(fā)酵液接近白色(圖2)。將該突變株基因組單酶切自連轉(zhuǎn)化后,從Kan抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST后,確定插入基因為mpq0056(Chorismate lyase,ubiC)(圖3)。

    2.3 mpq0056基因敲除

    2.3.1mpq0056基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 采用引物up1500-F/up1500-R和down1500-F/down1500-R菌落PCR驗證構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pGX-up-Gm-down,均在1500 bp處出現(xiàn)特異性條帶,與預期相符(圖4)。將敲除質(zhì)粒送北京六合華大公司測序,結(jié)果進一步證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    2.3.2mpq0056基因敲除菌的鑒定 選用引物up1700-F/Gm-R、Gm-F/down1700-R、Gm-F/Gm-R,以敲除菌基因組為模板進行組合PCR鑒定,應分別擴增出2500、2500、800 bp的片段,而以野生菌基因組為模板時應為陰性結(jié)果,結(jié)果與以上預期完全一致(圖5),說明mpq0056基因敲除成功。

    圖1 缺陷株抗性基因及轉(zhuǎn)座片段的PCR鑒定M:DNA marker;1:空白對照;2:陽性對照;3:1-52 PCR擴增Kan序列;4:1-52 PCR擴增轉(zhuǎn)座序列

    圖2 野生菌J1-1和突變株1-52發(fā)酵液

    圖3 1-52突變株Tn5插入位點

    圖4 pGX-up-Gm-down菌落PCR鑒定M:DNA marker;1:空白對照;2:陽性對照;3:mpq0056上游同源臂基因;4:mpq0056下游同源臂基因

    圖5 敲除菌J1-1Δ0056的組合PCR鑒定M:DNA marker;1:空白對照;2:野生菌(up1700-F/Gm-R);3:敲除菌(up1700-F/Gm-R);4:野生菌(Gm-F/down1700-R);5:敲除菌(Gm-F/down1700-R);6:野生菌(Gm-F/Gm-R);7:敲除菌(Gm-F/Gm-R)

    2.4 mpq0056基因回補及過表達

    用啟動子預測軟件BPROM預測結(jié)果顯示在mpq0056基因上游200 bp內(nèi)存在啟動子序列(圖6)。將mpq0056基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)克隆到載體pCM66中,構(gòu)建pCM66-0056載體,經(jīng)XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切后出現(xiàn)2條DNA帶,約8000 bp的條帶與載體pCM66大小一致,約700 bp的條帶與mpq0056的啟動子和編碼區(qū)片段大小一致(圖7),表明pCM66-0056重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

    提取回補菌株和過表達菌株質(zhì)粒復轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α,提取質(zhì)粒,用引物mpq0056-F/mpq0056-R測序,結(jié)果顯示回補株和過表達菌株構(gòu)建成功。

    2.5 菌株表型鑒定

    用分光光度法檢測突變株1-52的生長及PQQ合成水平,突變株生長速度略慢,同時PQQ合成水平只有野生株的1/7~1/6。向突變株培養(yǎng)基中額外添加終濃度為10 mg/L的PQQ標準品(用“+”表示),突變株的生長基本恢復正常,但單位細胞的PQQ合成水平依然很低(圖8)。表明突變基因mpq0056與PQQ的生物合成是有關(guān)聯(lián)的。

    敲除mpq0056基因后,敲除菌生長正常,單位細胞PQQ合成水平下降顯著,與Tn5誘變得到的結(jié)果相符;回補及過表達菌株的生長均正常,回補基因mpq0056后,PQQ合成水平回復到野生菌水平(圖9)。以上結(jié)果進一步說明基因mpq0056與PQQ的生物合成是相關(guān)的。

    3 討論

    隨著后基因組時代的到來,發(fā)現(xiàn)新基因和挖掘功能基因的方法越來越多,其中構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體庫是最直接有效的方法之一。Tn5轉(zhuǎn)座子是復合型轉(zhuǎn)座子,在宿主中單拷貝復制。相比于常規(guī)的轉(zhuǎn)座技術(shù),Tn5具有突變性狀穩(wěn)定、突變基因容易定位、抗性篩選等優(yōu)勢[10],操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高,能夠快速獲得大量穩(wěn)定遺傳的Tn5轉(zhuǎn)座突變株。實踐證明利用Tn5轉(zhuǎn)座誘變篩選食甲基桿菌J1-1中PQQ合成基因的方法是可行的。前期研究發(fā)現(xiàn),J1-1可利用的碳源并不多,其中以甲醇和果糖為碳源時菌體生長良好,當PQQ合成基因pqqBCDE敲除后,在果糖培養(yǎng)基中生長良好,卻不能利用甲醇為碳源生長,當敲除菌中加入痕量的外源PQQ后菌體生長正常,這一現(xiàn)象說明菌體利用甲醇為碳源時是PQQ依賴的。本研究經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座誘變篩選PQQ合成基因是在以甲醇為碳源的平板上篩選,因以甲醇為碳源時PQQ合成水平高,表型明顯,便于篩選,但目前這種方法只能篩選到PQQ合成水平下降的突變株,不合成PQQ突變株在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中不生長。后續(xù)將嘗試利用以果糖為碳源的平板進一步篩選PQQ合成基因。

    圖6 mpq0056上游前200 bp的啟動子預測分析

    圖7 pCM66-0056雙酶切鑒定M:DNA marker;1:pCM66-0056質(zhì)粒XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切

    圖8 突變株1-52的生長及PQQ合成水平檢測

    圖9 mpq0056基因敲除、回補及過表達菌生長和PQQ合成水平檢測

    綜上,經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座誘變獲得一株插入位點為mpq0056的PQQ合成缺陷突變株,BLAST分析結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物可能是分支酸裂合酶,Nichols[11]等研究顯示該酶在大腸桿菌中催化分支酸生成丙酮酸和對羥基苯甲酸,一方面作為泛醌類物質(zhì)合成的前體,參與催化泛醌生物合成的第一步反應,另一方面作為芳香族氨基酸生物合成的中間代謝產(chǎn)物。通過基因組位置分析發(fā)現(xiàn),mpq0056與上游基因mpq0055(ATP-dependent DNA helicase RecG)間隔區(qū)為73 bp,經(jīng)在線啟動子預測軟件BPROM分析顯示此間隔區(qū)存在啟動子序列,提示mq0055與mpq0056基因不是同一基因簇,未影響上游基因功能;與下游基因mpq0057(4-hydroxybenzoate polyprenyl transferase,ubiA)間隔區(qū)為78 bp,功能注釋存在相關(guān)性。我們推測食甲基桿菌J1-1中基因mpq0056影響PQQ生物合成的機制可能是通過影響芳香族氨基酸的代謝,間接影響PQQ前體物質(zhì)合成。其影響機制須后續(xù)實驗闡明。

    [1] Duine J A,van der Meer R A,Groen B W.The co?factor pyrroloquinoline quinone[J].Annu Rev Nutr, 1990,10(10):297-318.

    [2] 熊順華,唐俊明,郭青平,等.吡咯喹啉醌D-半乳糖致大鼠皮層衰老的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2007,17 (15):1837-1840.

    [3] Zhu B Q,Simonis U,Cecchini G,et al.Comparison of pyrroloquinoline quinone and/or metoprolol on myo?cardial infarct size and mitochondrial damage in a rat modelofischemia/reperfusion injury[J].JCardiovasc Pharmacol Ther,2006,11(2):119-128.

    [4] Stites T,Storms D,Bauerly K,et al.Pyrroloquinoline quinone modulates mitochondrial quantity and function in mice[J].J Nutr,2006,136(2):390-396.

    [5] Shen Y Q,Bonnot F,Imsand E M,et al.Distribution and properties of the genes encoding the biosynthesis ofthebacterialcofactor,pyrroloquinolinequinone[J]. Biochemistry,2012,51(11):2265-2275.

    [6] Puehringer S,Metlitzky M,Schwarzenbacher R.The pyrroloquinoline quinone biosynthesis pathway revisit?ed:a structural approach[J].BMC Mol Biol,2008,9(8): 1-11.

    [7] Xiong X H,Zhi J J,Yang L,et al.Complete genome sequence ofthe bacterium Methylovorus sp.strain MP688,a high-level producer of pyrroloquinolone qui?none[J].J Bacteriol,2011,193(4):1012-1013.

    [8] 奧斯伯,布倫特,金斯頓,等.精編分子生物學實驗指南[M].顏子穎,王海林,譯.北京:科學出版社,1998.

    [9] 楊延新,熊向華,游松,等.3種檢測吡咯喹啉醌的方法比較[J].生物技術(shù)通訊,2011,21(4):554-557.

    [10]年洪娟,陳麗梅,李昆志.Tn5轉(zhuǎn)座突變技術(shù)在革蘭氏陰性細菌分子遺傳研究中的應用[J].中國生物工程雜志,2009,29(12):114-118.

    [11]Nichols B P,Green J M.Cloning and sequencing of Escherichia coli ubiC and purification of chorismate ly?ase[J].J Bacteriol,1992,174(16):5309-5316.

    猜你喜歡
    發(fā)酵液碳源抗性
    緩釋碳源促進生物反硝化脫氮技術(shù)研究進展
    一個控制超強電離輻射抗性開關(guān)基因的研究進展
    不同碳源對銅溜槽用鋁碳質(zhì)涂抹料性能的影響
    昆鋼科技(2021年6期)2021-03-09 06:10:20
    連翹內(nèi)生真菌的分離鑒定及其發(fā)酵液抑菌活性和HPLC測定
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    甲基對硫磷抗性菌的篩選及特性研究
    甜玉米常見病害的抗性鑒定及防治
    中國果菜(2016年9期)2016-03-01 01:28:44
    四甘醇作碳源合成Li3V2(PO4)3正極材料及其電化學性能
    用于黃瓜白粉病抗性鑒定的InDel標記
    中國蔬菜(2015年9期)2015-12-21 13:04:40
    外加碳源對污水廠異常進水時的強化脫氮效果分析
    河南科技(2014年16期)2014-02-27 14:13:33
    国产单亲对白刺激| 涩涩av久久男人的天堂| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲av美国av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产成人欧美| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 97人妻天天添夜夜摸| 涩涩av久久男人的天堂| 国产精品免费一区二区三区在线 | 99热国产这里只有精品6| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99精品在免费线老司机午夜| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费在线观看影片大全网站| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美日本中文国产一区发布| 18禁美女被吸乳视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费不卡黄色视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 制服人妻中文乱码| 校园春色视频在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 国产精品成人在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 中文字幕人妻熟女乱码| 三级毛片av免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 人人澡人人妻人| 在线国产一区二区在线| 成人永久免费在线观看视频| 在线观看66精品国产| 久久久精品区二区三区| 三上悠亚av全集在线观看| ponron亚洲| 1024香蕉在线观看| 99香蕉大伊视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 丰满的人妻完整版| 日日夜夜操网爽| 丝袜美足系列| 久久精品国产a三级三级三级| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久国产精品麻豆| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产欧美一区二区综合| 999精品在线视频| 亚洲一区中文字幕在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产精品免费一区二区三区在线 | 十八禁人妻一区二区| 国产色视频综合| 欧美日韩一级在线毛片| 精品欧美一区二区三区在线| 久久热在线av| 丝袜美足系列| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲美女黄片视频| 嫩草影视91久久| 一a级毛片在线观看| 午夜福利在线免费观看网站| 国产成人欧美在线观看 | 男人的好看免费观看在线视频 | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 人妻一区二区av| 十八禁人妻一区二区| 欧美久久黑人一区二区| 韩国精品一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 国产成人免费观看mmmm| 午夜激情av网站| 国产av一区二区精品久久| 久久久久久久久久久久大奶| 黄色怎么调成土黄色| 午夜视频精品福利| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品国产av在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产有黄有色有爽视频| 国产精品欧美亚洲77777| 久久国产精品影院| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲五月婷婷丁香| 久久国产亚洲av麻豆专区| 好男人电影高清在线观看| 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 两个人免费观看高清视频| 中文字幕色久视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 一级片'在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 国产一区二区激情短视频| x7x7x7水蜜桃| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美在线黄色| 嫁个100分男人电影在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 国产成人欧美在线观看 | 这个男人来自地球电影免费观看| av福利片在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 看片在线看免费视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲 国产 在线| 久久精品国产清高在天天线| 91av网站免费观看| 一区在线观看完整版| 日韩欧美在线二视频 | 天堂中文最新版在线下载| 日本一区二区免费在线视频| 日韩欧美在线二视频 | 久久中文字幕人妻熟女| 三级毛片av免费| 一级毛片女人18水好多| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 1024视频免费在线观看| 国产av一区二区精品久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 超色免费av| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品久久午夜乱码| 水蜜桃什么品种好| 亚洲国产精品sss在线观看 | 国产乱人伦免费视频| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品 国内视频| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲成人手机| 久久久久久人人人人人| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品乱久久久久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 男男h啪啪无遮挡| 飞空精品影院首页| 天天操日日干夜夜撸| 成人影院久久| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲 国产 在线| 欧美午夜高清在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品免费久久久久久久清纯 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产精品成人在线| 国产激情久久老熟女| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 交换朋友夫妻互换小说| aaaaa片日本免费| 色播在线永久视频| 18禁观看日本| 午夜福利免费观看在线| 一进一出抽搐动态| 国产高清videossex| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av电影在线进入| 久久香蕉精品热| 99国产精品一区二区三区| 婷婷成人精品国产| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 欧美久久黑人一区二区| 黄色成人免费大全| 日韩精品免费视频一区二区三区| а√天堂www在线а√下载 | 免费观看人在逋| 正在播放国产对白刺激| 十八禁高潮呻吟视频| av网站免费在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 丁香欧美五月| 一区在线观看完整版| 亚洲专区字幕在线| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 女同久久另类99精品国产91| 91av网站免费观看| 国产1区2区3区精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 夫妻午夜视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 黄频高清免费视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 看免费av毛片| 热re99久久精品国产66热6| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 最新的欧美精品一区二区| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜免费成人在线视频| 久久香蕉激情| 欧美日韩精品网址| 精品久久久久久久毛片微露脸| av一本久久久久| 亚洲伊人色综图| 最新的欧美精品一区二区| 韩国av一区二区三区四区| a级片在线免费高清观看视频| 日本vs欧美在线观看视频| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| videosex国产| 欧美精品av麻豆av| 日韩精品免费视频一区二区三区| e午夜精品久久久久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲av电影在线进入| 搡老乐熟女国产| 精品亚洲成国产av| 久9热在线精品视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产野战对白在线观看| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久久久人人人人人| 国产精品免费一区二区三区在线 | 国产欧美日韩综合在线一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美在线一区亚洲| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品.久久久| 黄色丝袜av网址大全| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产国语露脸激情在线看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久久国产精品麻豆| 欧美大码av| 无遮挡黄片免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 99国产精品一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久| 黑人猛操日本美女一级片| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产国语露脸激情在线看| 久久香蕉精品热| 日本a在线网址| 一级毛片精品| 国产精品久久久人人做人人爽| 日本wwww免费看| 曰老女人黄片| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 一级黄色大片毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产精品一区二区精品视频观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产1区2区3区精品| a级片在线免费高清观看视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 无遮挡黄片免费观看| 欧美日韩一级在线毛片| 身体一侧抽搐| 色精品久久人妻99蜜桃| 色婷婷久久久亚洲欧美| 久久中文字幕一级| 咕卡用的链子| 大香蕉久久网| 丰满迷人的少妇在线观看| 天天影视国产精品| 国产成人欧美在线观看 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 啦啦啦 在线观看视频| 免费在线观看黄色视频的| 久久国产精品影院| 久久精品91无色码中文字幕| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 久久婷婷成人综合色麻豆| av网站免费在线观看视频| 国产成+人综合+亚洲专区| 久久久水蜜桃国产精品网| 制服人妻中文乱码| 午夜免费观看网址| 欧美精品av麻豆av| 亚洲视频免费观看视频| 多毛熟女@视频| 久久久国产欧美日韩av| aaaaa片日本免费| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产成人影院久久av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| videosex国产| 黄色毛片三级朝国网站| 十八禁网站免费在线| 中文字幕最新亚洲高清| 黄色女人牲交| 校园春色视频在线观看| 搡老岳熟女国产| 操出白浆在线播放| 男人舔女人的私密视频| 热99re8久久精品国产| 老司机靠b影院| 一区二区三区精品91| 亚洲色图av天堂| 日本a在线网址| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲中文av在线| 久久国产精品人妻蜜桃| 精品乱码久久久久久99久播| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美激情 高清一区二区三区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 免费少妇av软件| 性少妇av在线| av中文乱码字幕在线| 人人妻人人澡人人看| 欧美 日韩 精品 国产| 91国产中文字幕| 国产视频一区二区在线看| 国产精品 国内视频| 色老头精品视频在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文字幕av电影在线播放| 老汉色av国产亚洲站长工具| 怎么达到女性高潮| 久久香蕉国产精品| 看黄色毛片网站| 女人久久www免费人成看片| 精品少妇久久久久久888优播| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产精品永久免费网站| 国产欧美日韩一区二区三| 日韩欧美在线二视频 | 国产99久久九九免费精品| 亚洲男人天堂网一区| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲第一青青草原| 精品国产乱子伦一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲 欧美一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲在线自拍视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 大香蕉久久网| 亚洲国产欧美网| 亚洲人成77777在线视频| 在线国产一区二区在线| 国产有黄有色有爽视频| 女性被躁到高潮视频| 男女免费视频国产| 激情在线观看视频在线高清 | 国产精品久久久久久精品古装| 桃红色精品国产亚洲av| 国产99白浆流出| 久久精品亚洲av国产电影网| 少妇粗大呻吟视频| av福利片在线| 丝瓜视频免费看黄片| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲 国产 在线| 午夜老司机福利片| 色在线成人网| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 成年人午夜在线观看视频| 啦啦啦免费观看视频1| 天堂√8在线中文| 成年女人毛片免费观看观看9 | 在线视频色国产色| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 制服诱惑二区| 亚洲精品av麻豆狂野| 日本欧美视频一区| 国产精品成人在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品九九99| 精品久久蜜臀av无| 丝袜在线中文字幕| 免费人成视频x8x8入口观看| 窝窝影院91人妻| 啦啦啦免费观看视频1| 免费在线观看黄色视频的| 在线观看66精品国产| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 啦啦啦免费观看视频1| 女警被强在线播放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产成人av激情在线播放| 精品视频人人做人人爽| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲精品国产区一区二| 久久精品91无色码中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 久久中文字幕一级| 亚洲色图av天堂| 99riav亚洲国产免费| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜影院日韩av| 老司机午夜福利在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 视频在线观看一区二区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 午夜影院日韩av| 国产区一区二久久| 少妇粗大呻吟视频| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产亚洲欧美精品永久| 久久人人97超碰香蕉20202| 十八禁人妻一区二区| www日本在线高清视频| 老司机影院毛片| 怎么达到女性高潮| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 少妇的丰满在线观看| 亚洲欧美激情在线| 99热国产这里只有精品6| 精品亚洲成a人片在线观看| 亚洲综合色网址| 热99久久久久精品小说推荐| 脱女人内裤的视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| av免费在线观看网站| 青草久久国产| 国产精品影院久久| 国产男女内射视频| 男女床上黄色一级片免费看| 91在线观看av| 亚洲五月天丁香| 不卡一级毛片| 999久久久精品免费观看国产| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| av中文乱码字幕在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲七黄色美女视频| 一级a爱视频在线免费观看| 91国产中文字幕| 嫩草影视91久久| 777米奇影视久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久 成人 亚洲| 免费观看人在逋| 一二三四在线观看免费中文在| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜福利视频在线观看免费| 夫妻午夜视频| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲专区字幕在线| 最新的欧美精品一区二区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 黄色女人牲交| 看片在线看免费视频| 18禁美女被吸乳视频| 国产亚洲av高清不卡| 久久九九热精品免费| 国产精品影院久久| 国产精品欧美亚洲77777| 久久久久精品人妻al黑| 高清欧美精品videossex| 视频在线观看一区二区三区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产单亲对白刺激| 免费在线观看完整版高清| 在线国产一区二区在线| 久久久久久久久久久久大奶| ponron亚洲| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲久久久国产精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 一级片免费观看大全| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产单亲对白刺激| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 香蕉久久夜色| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 黄色 视频免费看| av片东京热男人的天堂| 他把我摸到了高潮在线观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产欧美一区二区综合| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产欧美亚洲国产| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 男人操女人黄网站| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 两个人看的免费小视频| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看66精品国产| 无人区码免费观看不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日日夜夜操网爽| 在线看a的网站| 美女视频免费永久观看网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜免费观看网址| 91九色精品人成在线观看| 麻豆av在线久日| 丝瓜视频免费看黄片| 免费av中文字幕在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美不卡视频在线免费观看 | 热re99久久国产66热| 国产精品 国内视频| 亚洲专区中文字幕在线| 夫妻午夜视频| 露出奶头的视频| 欧美日韩av久久| 一进一出抽搐动态| av视频免费观看在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 一级片免费观看大全| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黑人猛操日本美女一级片| videosex国产| 亚洲五月色婷婷综合| 99久久精品国产亚洲精品| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜91福利影院| 嫁个100分男人电影在线观看| 好男人电影高清在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费少妇av软件| 777米奇影视久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 91大片在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 真人做人爱边吃奶动态| 黄色视频,在线免费观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 久久久久久久久久久久大奶| 久久香蕉精品热| 久久久国产成人免费| www.自偷自拍.com| 国产97色在线日韩免费| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 1024香蕉在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 国产免费现黄频在线看| 欧美乱码精品一区二区三区| 黄色视频,在线免费观看| 高清欧美精品videossex| 天堂中文最新版在线下载| 老司机在亚洲福利影院| 久久久久国内视频| 丝袜在线中文字幕| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 国产xxxxx性猛交| 欧美大码av| 黄色视频不卡| 黄色毛片三级朝国网站| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 黄色怎么调成土黄色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 男女免费视频国产| 在线观看免费视频日本深夜| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 新久久久久国产一级毛片| 中文字幕色久视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 亚洲情色 制服丝袜| 亚洲精品粉嫩美女一区| 热re99久久国产66热| 国产伦人伦偷精品视频| 曰老女人黄片| 一区在线观看完整版| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产激情久久老熟女| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲成人手机| 天堂中文最新版在线下载| 午夜激情av网站| 成人黄色视频免费在线看| videos熟女内射| 制服人妻中文乱码| 露出奶头的视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 性色av乱码一区二区三区2| 高清欧美精品videossex| 久久精品亚洲av国产电影网| 免费黄频网站在线观看国产| www.熟女人妻精品国产|