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    人突觸囊泡蛋白2C單克隆抗體的制備及鑒定

    2018-04-09 03:37:20邱語進(jìn)孫志杰趙鵬付楚溪霍江熊向華汪建華萬冬梅張惟材
    生物技術(shù)通訊 2018年2期
    關(guān)鍵詞:親和力效價(jià)孵育

    邱語進(jìn),孫志杰,趙鵬,付楚溪,霍江,熊向華,汪建華,萬冬梅,張惟材

    1.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院,遼寧 沈陽 110036;2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所,北京 100071;3.沈陽藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,遼寧 沈陽 110016;4.沈陽師范大學(xué),遼寧 沈陽 110034;5.解放軍第307醫(yī)院 麻醉科,北京 100071

    肉毒毒素(botulinum neurotoxin,BoNT)是一類由厭氧肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botuli?num)產(chǎn)生的神經(jīng)毒素,是迄今已知毒性最強(qiáng)的蛋白毒素[1-3]。肉毒毒素共有7種血清型(A~G),其中A型最為常見,近年來已應(yīng)用于美容和治療偏頭痛、眼能動(dòng)性、運(yùn)動(dòng)障礙等疾病[4-5]。A型肉毒毒素由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接構(gòu)成,重鏈的N端為跨膜區(qū)、C端為受體結(jié)合區(qū),輕鏈為依賴Zn2+的內(nèi)肽酶。A型肉毒毒素(BoNT/A)在神經(jīng)肌肉接頭處與神經(jīng)細(xì)胞表面的受體結(jié)合,借助重鏈N端跨膜將輕鏈送至胞內(nèi),通過切割突觸囊泡相關(guān)蛋白SNAP25從而阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,引發(fā)肌肉持續(xù)的松弛性麻痹[6-7]。

    突觸囊泡蛋白2(synaptic vesicle protein 2,SV2)是一類在內(nèi)分泌泡及突觸囊泡廣泛表達(dá)的跨膜糖蛋白,包含12次跨膜的疏水結(jié)構(gòu)域(trans?membrane regions,TMR),具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、內(nèi)分泌泡胞吐作用、維持突觸囊泡穩(wěn)態(tài)及參與神經(jīng)肌肉接頭形成等生物學(xué)功能。Dong等研究發(fā)現(xiàn)SV2的3個(gè)亞型SV2A、SV2B、SV2C均可作為BoNT/A的受體,其中SV2C與BoNT/A的親和力最高[8],其TMR7、TMR8之間的突觸泡大突環(huán)L4上的529~566位氨基酸與BoNT/A結(jié)合[7,9-10]。本研究中我們表達(dá)純化了SV2C/L4蛋白,免疫小鼠后經(jīng)2輪篩選得到13株單抗,其中30號(hào)抗體與SV2C的親和力最高,且具有一定的中和活性。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    昆明小鼠購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;pGEX-KG-SV2C/L4質(zhì)粒由本課題組構(gòu)建;脫脂奶粉購(gòu)自生工生物工程股份有限公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、TMB顯色液購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司;Western印跡試劑盒、Proteinlso GST Resin購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自北京博奧龍免疫有限公司;酶標(biāo)板、細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自康寧公司;PVDF膜購(gòu)自Merk Millipore公司;HiTraP Protein G HP購(gòu)自GE Healthcare公司。

    1.2 制備抗原SV2C

    將構(gòu)建的pGEX-KG-SV2C/L4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),挑取陽性克隆接種于200 mL含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中,于37℃、220 r/min培養(yǎng)至D600nm為0.5~0.8,加入終濃度0.5 mmol/L的IPTG于20℃誘導(dǎo)18 h,4℃、12 000 r/ min離心收集菌體,加20 mL裂解液重懸,置于冰上超聲波裂解菌體,4℃、12 000 r/min離心收集上清,按1∶2000的比例加入GST瓊脂糖珠,4℃結(jié)合2 h,先用洗滌緩沖液漂洗4次,后用洗脫緩沖液洗脫并收集洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

    1.3 雜交瘤細(xì)胞篩選

    采用4只SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠,每只小鼠初次免疫經(jīng)皮下多點(diǎn)注射60 μg SV2C/L4蛋白,加強(qiáng)免疫3次后測(cè)定小鼠血清效價(jià),選擇效價(jià)最高的小鼠提高免疫用量進(jìn)行腹腔沖擊,培養(yǎng)10 d后分離小鼠脾細(xì)胞,采用PEG法與生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的Sp2/0細(xì)胞融合,用半固體培養(yǎng)基(含HAT)篩選培養(yǎng)14~21 d,間接ELISA篩選陽性克隆。動(dòng)物免疫與雜交瘤細(xì)胞初篩交由北京華大蛋白研發(fā)中心有限公司完成。

    1.4 抗體效價(jià)測(cè)定

    用5 μg/mL的SV2C抗原37℃孵育2 h,PBST洗滌3次;用5%脫脂牛奶37℃封閉2 h,PBS-T洗滌3次;細(xì)胞上清按1∶200稀釋作為起始濃度,然后按1∶2梯度稀釋共10個(gè)濃度,取100 μL依次加入酶標(biāo)板,37℃孵育1 h,PBS-T洗滌3次;二抗羊抗鼠1∶2000稀釋,37℃孵育1 h,PBS-T洗滌3次;顯色5~10 min,終止反應(yīng)后讀數(shù)。

    1.5 抗體亞型鑒定

    取細(xì)胞培養(yǎng)上清,按試劑盒說明書鑒定抗體亞型。

    1.6 抗體制備

    每只BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟預(yù)處理1周,之后經(jīng)相同途徑注射0.5 mL濃度為2×106/mL的細(xì)胞懸液,7~10 d見小鼠腹部明顯膨大即可剖腹收集腹水,離心收集上清。用結(jié)合緩沖液稀釋小鼠腹水,4℃、12 000 r/min離心10 min,取上清,Protein G親和柱上樣,平衡至基線平穩(wěn),加入洗脫緩沖液洗脫,收集洗脫峰,SDSPAGE鑒定后分裝于-20℃保存。

    1.7 抗體結(jié)合表位類型鑒定

    取20 μL純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE,半干法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉2 h,PBS-T洗膜,待測(cè)抗體按1∶1000的比例稀釋,室溫孵育1 h,PBS-T洗膜,二抗羊抗鼠按1∶2000的比例稀釋,室溫孵育1 h,PBS-T洗膜,顯色。

    1.8 抗體親和力常數(shù)測(cè)定

    將不同濃度(5、2.5、1.25、0.625 μg/mL)的SV2C/L4抗原依次加入酶標(biāo)板中包被,空白孔加入包被緩沖液,37℃孵育2 h;用5%脫脂牛奶37℃封閉2 h,PBS-T洗1次;將不同濃度(288 μg/mL,1/2梯度稀釋16個(gè)濃度)的一抗依次加到包被好的酶標(biāo)板中,37℃孵育1 h,PBS-T洗3次;羊抗鼠二抗按1∶2000稀釋,37℃孵育1 h,PBS-T洗3次;避光顯色5~15 min后終止反應(yīng),雙波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值,記錄數(shù)據(jù)。

    以抗體濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),D值為縱坐標(biāo),利用GraphPad Prism 5軟件擬合出不同抗原濃度的EC50,按Beaty[11]推導(dǎo)的公式計(jì)算K值并求平均值,即為親和力常數(shù)。

    1.9 抗體中和活性實(shí)驗(yàn)

    參照Diamant等的方法[12]進(jìn)行。

    2 結(jié)果

    2.1 抗原SV2C/L4的純化

    重組菌pGEX-KG-SV2C/L4/BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)后超聲波裂解,取裂解上清用于GST親和層析純化,SDS-PAGE分析顯示得到特異性純化蛋白條帶,與融合蛋白理論相對(duì)分子質(zhì)量相符,Gel-Pro Analyzer軟件分析蛋白純度達(dá)到95%以上(圖1)。

    圖1 目的蛋白純化的SDS-PAGE檢測(cè)M:蛋白marker;1,2:SV2C/L4純化蛋白

    2.2 雜交瘤細(xì)胞篩選和抗體分型

    用間接ELISA測(cè)定3次加強(qiáng)免疫后的4只小鼠的血清效價(jià),結(jié)果見表1,1號(hào)小鼠血清效價(jià)最高,選取1號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)。

    細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行2輪篩選,獲得13株陽性雜交瘤細(xì)胞,間接ELISA測(cè)定這13株細(xì)胞上清效價(jià)為6.4×103~1.024×105(表2),其中30號(hào)細(xì)胞上清的效價(jià)最高為1.024×105。測(cè)得抗體的重鏈大部分為IgG1、IgG2a型,輕鏈均為κ型(表2)。

    圖2 SV2C抗體純化的SDS-PAGE檢測(cè)M:蛋白marker;1:SV2C抗體

    2.3 抗體純化

    小鼠腹水經(jīng)Protein G柱親和層析純化,SDSPAGE分析抗體純度大于95%(圖2)。

    2.4 抗體結(jié)合表位類型鑒定

    Western印跡顯示并無明顯條帶,而ELISA結(jié)果表明鼠單抗可以與抗原SV2C/L4反應(yīng),由此推測(cè)該抗體結(jié)合表位類型是空間表位。

    表1 小鼠血清效價(jià)

    表2 13株抗體效價(jià)及亞型

    2.5 抗體親和力常數(shù)測(cè)定

    間接ELISA測(cè)定30號(hào)單抗與SV2C/L4抗原的親和力常數(shù),結(jié)合反應(yīng)曲線如圖3。用GraphPad Prism 5分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),抗原濃度為5、2.5、1.25、0.625 μg/mL時(shí)所對(duì)應(yīng)的EC50分別為0.570、1.083、2.334和2.203 ng/mL。代入公式K=2(nAbx-Aby)/(n-1)(n=x/y,x>y),計(jì)算所得K值的平均值即為親和力常數(shù)。最終計(jì)算得到30號(hào)單抗與SV2C/L4抗原的親和力常數(shù)K=6.7 nmol/L。

    2.6 抗體的中和活性

    中和活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,針對(duì)BoNT/A的30號(hào)抗體中和活性為100 LD50/mg。

    圖3 抗體SV2C與抗原親和力常數(shù)

    3 討論

    傳統(tǒng)理論認(rèn)為BoNT/A在神經(jīng)細(xì)胞表面有神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b和SV2等2種受體[13-16]。GT1b是一種酸性鞘糖脂,在神經(jīng)細(xì)胞表面數(shù)量較豐富,在細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮重要作用[18];SV2位于脊椎動(dòng)物的突觸泡與內(nèi)分泌泡上,與神經(jīng)肌肉接頭形成、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放相關(guān)。當(dāng)BoNT/A進(jìn)入神經(jīng)肌肉接頭后,首先與神經(jīng)細(xì)胞表面的GT1b結(jié)合并完成對(duì)毒素的富集[17];富集的毒素再與神經(jīng)細(xì)胞表面的蛋白受體SV2結(jié)合,并在SV2的介導(dǎo)下完成內(nèi)吞[16]。但是,2013年Jacky等研究發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(fi?broblast growth factor receptor 3,F(xiàn)GFR3)是BoNT/ A的一種新受體[18],其與毒素結(jié)合后會(huì)引發(fā)毒素內(nèi)吞。目前BoNT/A的3種受體特別是2種蛋白受體(SV2/FGFR3)的相互關(guān)系還不明確,我們希望制備2種蛋白受體的抗體來研究它們之間的相互關(guān)系。本研究中我們通過免疫小鼠篩選陽性雜交瘤細(xì)胞來制備SV2C特異性抗體,經(jīng)4次皮下注射和1次腹腔注射免疫BALB/c小鼠,選取血清效價(jià)最高的小鼠完成雜交瘤細(xì)胞制備,采用間接ELISA法進(jìn)行2輪篩選,最終得到了13株抗體。選取效價(jià)最高的30號(hào)抗體制備純化腹水,純化抗體與SV2C抗原的親和力常數(shù)為6.7 nmol/L,對(duì)BoNT/A的中和活性為100 LD50。我們得到1株高純度、高親和力并對(duì)BoNT/A具有一定中和活性的抗SV2C鼠單抗,為我們研究BoNT/A受體的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

    目前,針對(duì)BoNT/A中毒的治療尚無有效的化學(xué)藥物,而臨床使用的馬多抗存在過敏反應(yīng)等安全隱患,基因工程單抗是發(fā)展的主流方向。Nowakowski等獲得的S25、C25、3D12[19]和XOMA公司研發(fā)的NX01、NX02、NX11[20]單抗均具有很好的中和活性,但這些單抗都是針對(duì)BoNT/A的受體結(jié)合區(qū)。本研究篩選得到針對(duì)BoNT/A的SV2C受體的具有一定的中和活性的單抗,這一結(jié)果提示可以通過直接封閉BoNT/A的受體來達(dá)到治療目的,為肉毒中毒治療提供了新的途徑。

    [1] Peck M W.Biology and genomic analysis of Clostridi?um botulinum[J].AdvMicrob Physiol,2009,55:183-265.

    [2] Hill K K,Smith T J.Genetic diversity within clostridi?um botulinum,serotypes,botulinum neurotoxin gene clusters and toxin subtypes[M]//Botulinum Neurotoxins. Springer Berlin Heidelberg,2012:1.

    [3] Gill D M.Bacterial toxins:a table of lethal amounts [J].Microbiol Rev,1982,46(1):86.

    [4] Giménez D F,Giménez J A.The typing of botulinal neurotoxins[J].Int J Food Microbiol,1995,27(1):1.

    [5] Montal M.Botulinum neurotoxin:a marvel of protein design[J].Annu Rev Biochem,2010,79(1):591.

    [6] Montecucco C,Papini E,Schiavo G.Bacterial protein toxins penetrate cells via a four-step mechanism[J]. FEBS Lett,1994,346(1):92-98.

    [7] Dong M,Yeh F,Tepp W H,et al.SV2 is the pro? tein receptor for botulinum neurotoxin A[J].Science, 2006,312(5773):592-596.

    [8] Rummel A.Double receptor anchorage of botulinum neurotoxins accounts for their exquisite neurospecificity [M]//Botulinum Neurotoxins.Springer Berlin Heidel?berg,2012:61-90.

    [9] Levy R,Forsyth C M,Laporte S L,et al.Fine and domain-level epitope mapping of botulinum neurotoxin type A neutralizing antibodies by yeast surface display [J].J Mol Biol,2007,365(1):196-210.

    [10]韋娜,張惟材.突觸泡蛋白2研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2007,18(3):519-523.

    [11]王越劍,王建武,劉慶良.單克隆抗體親和力常數(shù)的簡(jiǎn)易測(cè)定[J].上海免疫學(xué)雜志,1991,(2):48-13.

    [12]Diamant E,Lachmi B E,Keren A,et al.Evaluating the synergistic neutralizing effect of anti-botulinum oli?goclonal antibody preparations[J].PLoS One,2014,9(1): e87089.

    [13]Montecucco C.How do tetanus and botulinum toxins bind to neuronal membranes[J].Trends Biochem Sci, 1986,11(8):314-317.

    [14]Rummel A,Eichner T,Weil T,et al.Identification of the protein receptor binding site of botulinum neurotox?ins B and G proves the double-receptor concept[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2007,104(1):359.

    [15]Berntsson R P,Peng L,Dong M,et al.Structure of dualreceptorbinding to botulinum neurotoxin B[J]. Nat Commun,2013,4(3):2058.

    [16]Binz T,Rummel A.Cell entry strategy of clostridial neurotoxins[J].J Neurochem,2009,109(6):1584-1595.

    [17]Huwiler A,Kolter T,Pfeilschifter J,et al.Physiology and pathophysiology ofsphingolipid metabolism and signaling[J].Biochim Biophys Acta,2000,1485(2-3):63.

    [18]Jacky B P S,Garay P E,Dupuy J,et al.Identifica?tion of fibroblast growth factor receptor 3 as a protein receptor for botulinum neurotoxin serotype A[J].PLoS Pathog,2013,9(5):210-216.

    [19]Nowakowski A,Wang C,Powers D B,et al.Potent neutralization of botulinum neurotoxin by recombinant oligoclonal antibody[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002, 99(17):11346-11350.

    [20]余云舟,孫志偉,鄭濤,等.肉毒毒素防治藥物的研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué),2012,36(12):954-958.

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