卵巢癌中線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1的表達(dá)及其意義

自加吉，孫美濤，王唯斯，陳瑩，戴莉萍，余敏，熊偉

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.大理州第一人民醫(yī)院 病理科，云南 大理671000；3.云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤的首位，且發(fā)病率逐年增加[1]。雖然近年發(fā)現(xiàn)了很多新的治療方式，但其預(yù)后仍未得到明顯改善[2]。目前，診斷卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子標(biāo)記物仍然十分有限。人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1（mitochondrial transcription termi?nationfactor1，MTERF1）基因定位于染色體7q21.2，包含4個(gè)外顯子，其編碼的蛋白由399個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，具有3個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和2個(gè)獨(dú)立的DNA結(jié)合區(qū)[3]。MTERF1蛋白與線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）上編 碼 16S rRNA基因與tRNALeu（UUR）基因分界處的一段28 bp的序列特異結(jié)合，從而終止mtDNA重鏈的轉(zhuǎn)錄[4]。對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞株的體外研究發(fā)現(xiàn)，MTERF1蛋白正調(diào)控腫瘤細(xì)胞的線粒體基因表達(dá)和氧化磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，提示MTERF1在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[5]。然而，MTERF1基因在人卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制仍不清楚。以基因芯片或轉(zhuǎn)錄組分析為代表的高通量測(cè)序目前已成為癌癥研究的強(qiáng)大工具，但由于樣本數(shù)量、測(cè)序平臺(tái)及分析方法的不同，常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差，分析結(jié)果比較片面。如何有效利用上述資源，是當(dāng)前科研人員面臨的重要問題。數(shù)據(jù)整合分析可聯(lián)合多種數(shù)據(jù)消除以上因素的影響，從整體角度來(lái)理解這些數(shù)據(jù)，因而生物數(shù)據(jù)整合分析逐漸成為大數(shù)據(jù)挖掘的重要方向，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種類型的癌癥分析中[6]。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)是大型腫瘤基因芯片整合數(shù)據(jù)庫(kù)，最新數(shù)據(jù)涵蓋已知所有的癌癥類型，包含715個(gè)數(shù)據(jù)集，共計(jì)86 733個(gè)癌組織及正常組織數(shù)據(jù)。利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)可以進(jìn)行腫瘤及其相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)差異分析，尋找潛在感興趣的基因，其整合的大量數(shù)據(jù)保證分析結(jié)果具有極大的參考價(jià)值，也可以發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)記物和基因治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘數(shù)據(jù)

本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)贠ncomine數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)定的篩選條件為：①Gene：MTERF1；②Analysis type：can?cervs.normalanalysis；③Cancertype：ovarian cancer；④Data type：mRNA；⑤Sample type：clini?cal specimen；⑥臨界值設(shè)定條件：P＜0.0001，fold change＞2.0，gene rank=top 10%。

1.2 Real time RT-PCR檢測(cè)MTERF1 mRNA在卵巢癌和正常卵巢上皮組織中的表達(dá)

選取2016年大理州第一人民醫(yī)院病理科收集的10例卵巢癌組織及其對(duì)應(yīng)的正常卵巢上皮組織，提取各組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，調(diào)整各組間cDNA濃度一致，用CFX96熒光定量PCR擴(kuò)增儀分別擴(kuò)增目的基因和內(nèi)參基因，目的基因和內(nèi)參基因引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72延伸10 min。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，即

表1 目的基因和內(nèi)參基因的引物序列

計(jì)算卵巢癌組織中MTERF1mRNA水平與其對(duì)應(yīng)正常卵巢上皮組織的mRNA水平的比值。

1.3 Western印跡檢測(cè)MTERF1蛋白在卵巢癌和正常卵巢上皮組織中的表達(dá)

提取10例卵巢癌及其配對(duì)正常卵巢上皮組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定各組蛋白質(zhì)的濃度。取40 μg蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE分離總蛋白，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%的脫脂牛奶封閉2 h，加入1∶1000稀釋的兔抗人MTERF1單克隆抗體，4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，內(nèi)參為GAPDH；TBST液洗滌3次，每次5 min，加入1∶2000稀釋的羊抗兔二抗，4℃孵育2 h；TBST洗滌3次，每次5 min。將超敏型ECL顯影液滴于PVDF膜條上，用ImageQuant LAS500超靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色曝光，掃描成圖像。采用Image J 1.46軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算MTERF1/GAP?DH灰度值比值。

1.4 Kaplan-Meier plotter分析患者生存周期

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)含有從基因表達(dá)匯編（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的包括mRNA表達(dá)和臨床資料的1657例卵巢癌病例信息。利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot. com/analysis/）的卵巢癌數(shù)據(jù)集對(duì)MTERF1進(jìn)行分析，得到相應(yīng)的Kaplan-Meier生存曲線、風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）及Log rankP（Pvalue）值。

1.4.1MTERF1表達(dá)水平與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系 探針選擇為JetSet best probe set，所需有效Affymetrix ID為204871_at（MTERF1）。首先根據(jù)MTERF1mRNA水平分為低表達(dá)組和高表達(dá)組，截尾數(shù)據(jù)為癌癥無(wú)進(jìn)展生存期（progression-freesurvival，PFS），符合條件的總病例數(shù)為1436例，分析MTERF1表達(dá)水平與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系；然后截尾數(shù)據(jù)為總生存期（overall survival，OS），符合條件總病例數(shù)為1657例，分析MTERF1表達(dá)水平與卵巢癌預(yù)后的關(guān)系。篩選條件為：①Cancer：Ovarian cancer；②Gene：MTERF1；③Survival：PFS or OS。

1.4.2MTERF1表達(dá)對(duì)不同分期卵巢癌患者預(yù)后的影響 探針選擇為JetSet best probe set，然后分別設(shè)截尾數(shù)據(jù)為OS和PFS，所需有效Affyme?trix ID為204871_at（MTERF1），在Stage選項(xiàng)下分別選擇1期、1+2期、2期、2+3期、2+3+4期、3期、3+4期、4期，在線分析MTERF1表達(dá)對(duì)不同分期卵巢癌患者預(yù)后的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

正常卵巢組織和卵巢癌病例組之間MTERF1表達(dá)的差異采用t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析MTERF1在卵巢癌中的表達(dá)

自2001年始，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中共有8個(gè)研究涉及MTERF1在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達(dá)，包括2211個(gè)樣本[7-12]。薈萃8個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，人MTERF1在卵巢癌中高表達(dá)，其中位數(shù)為3867.0，其高表達(dá)具有顯著性差異（P=0.042）。Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中有4個(gè)基因芯片數(shù)據(jù)集研究的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，顯示卵巢癌中MTERF1mRNA高表達(dá)（圖1）。

2.2 卵巢癌組織與正常卵巢上皮組織中MTERF1 mRNA的表達(dá)

Real time RT-PCR檢測(cè)10例卵巢癌及其配對(duì)正常卵巢上皮組織中MTERF1mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示6例卵巢癌組織的MTERF1mRNA水平較正常卵巢上皮組織顯著增高（P＜0.05），4例卵巢癌組織中增高不顯著（P＞0.05）（圖2）。

2.3 卵巢癌組織與正常卵巢上皮組織MTERF1蛋白的表達(dá)

Western印跡檢測(cè)10例配對(duì)卵巢癌與正常卵巢上皮組織中MTERF1蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果同樣顯示6例卵巢癌組織中MTERF1蛋白水平較正常卵巢上皮組織顯著增高（P＜0.05），4例卵巢癌組織中增高不顯著（P＞0.05），與mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)結(jié)果一致（圖3）。

2.4 卵巢癌患者的預(yù)后與MTERF1 mRNA表達(dá)量的關(guān)系

圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)部分所選隊(duì)列中MTERF1基因在卵巢癌中的表達(dá)研究結(jié)果A：Yoshihara等（P＜0.001）；B：TCGA（P=0.004）；C：Adib等（P=0.256）；D：Lu等（P=0.026）

采用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生存周期分析、風(fēng)險(xiǎn)比和Log-Rank檢驗(yàn)，進(jìn)一步明確MTERF1基因表達(dá)量與卵巢癌病人預(yù)后的關(guān)系。當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者PFS，數(shù)據(jù)庫(kù)中符合條件的病例總數(shù)為1436例，且涵蓋各個(gè)分期的卵巢癌病例。經(jīng)Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析，HR=1.22，log-rankP值為0.002。當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為卵巢癌患者OS，數(shù)據(jù)庫(kù)中符合條件的病例總數(shù)為1657例，Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析，HR=1.12，Log rankP值為0.091（圖4）。

2.5 各分期卵巢癌患者預(yù)后與MTERF1 mRNA水平的關(guān)系

圖2 10例卵巢癌與其相應(yīng)的正常卵巢上皮組織中MTERF1 mRNA表達(dá)水平的比值（*P＜0.05）

截尾數(shù)據(jù)為PFS時(shí)，早期卵巢癌（1、1+2或2期）中MTERF1表達(dá)水平越高，患者無(wú)進(jìn)展生存期越短，預(yù)后越差（HR＞1）（表2）。其中，1+2期卵巢癌中HR值為2.23，表明越早期的卵巢癌患者，MTERF1的預(yù)后價(jià)值越大。將截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為OS，MTERF1的表達(dá)水平與卵巢癌患者的預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。因此，早期（1+2期）卵巢癌患者中MTERF1mRNA水平越高，無(wú)進(jìn)展生存期越短，預(yù)后越差（P＜0.05）。

3 討論

圖3 10例卵巢癌與其相應(yīng)的正常卵巢上皮組織中MTERF1蛋白表達(dá)水平的比值（*P＜0.05）

卵巢癌在女性常見惡性腫瘤中占2.4%～6.5%，在女性生殖系統(tǒng)癌瘤中占第3位，次于宮頸癌和宮體癌。但在女性生殖系統(tǒng)癌瘤中，卵巢癌的病死率最高[13]，75%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，并且具有比較明顯的個(gè)體差異性[14]。目前，臨床用于卵巢癌診斷的腫瘤標(biāo)記物十分有限。發(fā)現(xiàn)能用于診斷和預(yù)后的卵巢癌分子標(biāo)記物具有現(xiàn)實(shí)意義。

圖4 MTERF1 mRNA表達(dá)量與卵巢癌患者預(yù)后的關(guān)系A(chǔ)：截尾數(shù)據(jù)為PFS；B：截尾數(shù)據(jù)為OS

MTERF1基因是MTERF超基因家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員。研究表明，與MTERF1蛋白結(jié)合的線粒體tRNALeu（UUR）基因A3243G位點(diǎn)的堿基突變，將引起線粒體糖尿病、線粒體腦肌病伴高?乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征、進(jìn)行性眼外肌麻痹等疾病。mtDNA靶序列A3243G點(diǎn)突變引起人MTERF1與DNA的親合力下降，但并不改變線粒體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的的比例，但線粒體蛋白質(zhì)合成能力和細(xì)胞的呼吸活性下降將導(dǎo)致線粒體疾病[15]。目前，關(guān)于MTERF1基因在卵巢癌中的表達(dá)及其意義尚未見相關(guān)報(bào)道。Oncomine是一個(gè)大型腫瘤基因芯片分析整合數(shù)據(jù)庫(kù)，提供公開、免費(fèi)的整合分析資源，數(shù)據(jù)來(lái)源為公開發(fā)表的各種高通量測(cè)序數(shù)據(jù)。Oncomine平臺(tái)為不熟悉高通量分析的科研工作者提供了獲取整合信息的便捷途徑，輸入基因名稱即可得到該基因在各種類型腫瘤中的表達(dá)差異等分析結(jié)果，并且以直觀的形式輸出[16]。通過對(duì)Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的整合分析，我們發(fā)現(xiàn)MTERF1在卵巢癌中顯著高表達(dá)。我們分別采用熒光定量PCR和Western印跡對(duì)10例卵巢癌組織及其配對(duì)的正常卵巢上皮組織中MTERF1mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)6例卵巢癌組織中MTERF1高表達(dá)，其結(jié)果得到進(jìn)一步證實(shí)。本研究的不足之處為樣本數(shù)量有限，亟待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

Kaplan-Meier plotter是目前被廣泛接受的一個(gè)預(yù)后相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)，涵蓋了10 461例腫瘤樣本，其中包括1816例卵巢癌樣本、5143例乳腺癌樣本、1065例胃癌樣本和2437例肺癌樣本，可以對(duì)54 675個(gè)基因進(jìn)行相關(guān)預(yù)后分析，并得出真實(shí)可信的客觀結(jié)果[17-18]。本研究首次通過Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(kù)探討MTERF1在卵巢癌及不同分期卵巢癌中的預(yù)后價(jià)值。結(jié)果顯示，卵巢癌分期未明時(shí)，MTERF1表達(dá)水平越高，患者的無(wú)進(jìn)展生存期越短，預(yù)后越差。但MTERF1表達(dá)水平與卵巢癌患者的總生存期無(wú)相關(guān)性。在1+2期卵巢癌，當(dāng)截尾數(shù)據(jù)設(shè)置為PFS時(shí)，HR值為2.23，Log rankP＜0.01；而當(dāng)截尾數(shù)據(jù)為OS時(shí)，HR值為1.53，Log rankP=0.59?？紤]到OS為總生存率，患者死亡原因可能存在非腫瘤致死，推測(cè)MTERF1可以較好地用于1+2期卵巢癌患者預(yù)后；而在晚期（3期及以后）卵巢癌患者中，無(wú)論是PFS還是OS，都與MTERF1的表達(dá)水平?jīng)]有顯著相關(guān)性，因此推測(cè)MTERF1對(duì)晚期卵巢癌不具備預(yù)后價(jià)值。

表2 各個(gè)分期卵巢癌患者的預(yù)后與MTERF1 mRNA水平的關(guān)系

綜上所述，我們通過Oncomine和Kaplan-Mei?er plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)腫瘤相關(guān)基因的信息進(jìn)行深入挖掘，提出MTERF1在卵巢癌組織中高表達(dá)；通過real time RT-PCR和Western印跡對(duì)卵巢癌及其配對(duì)的正常卵巢上皮組織中MTERF1mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，證實(shí)MTERF1在卵巢癌組織中高表達(dá)；進(jìn)而分析MTERF1表達(dá)對(duì)卵巢癌患者預(yù)后的影響，發(fā)現(xiàn)MTERF1與早期卵巢癌的預(yù)后有關(guān)，為進(jìn)一步探討MTERF1在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancer statistics, 2015[J].CA Cancer J Clin,2015,65(1):5-29.

[2] 李莉,熊國(guó)平,顏琳,等.CCNB1在卵巢癌中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2016,25(11):818-820.

[3] 熊偉,楊勇琴,張海洋,等.人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子1 (hMTERF1)蛋白的生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué), 2015,13(1):23-30.

[4] 熊偉,余敏,左紹遠(yuǎn).線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子蛋白家族在線粒體基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2015,31(3):223-231.

[5] Chen G,Dai J,Tan S,et al.MTERF1 regulates the oxidative phosphrylation activity and cell proliferation in C-33A cells[J].Acta Biochim Biophys Sin,2014, 46(6):512-521.

[6] 王巍,張志常,宋曉雯,等.基于數(shù)據(jù)挖掘分析PDCD5表達(dá)對(duì)胃癌預(yù)后的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2016,24(24): 3957-3959.

[7] Adib T R,Henderson S,Perrett C,et al.Predicting biomarkers for ovarian cancer using gene-expression microarrays[J].Br J Cancer,2004,90(3):686-692.

[8] Bonome T,Levine D A,Randonovich M,et al.A gene signature predicting for survival in subopimally debulked patients with ovarian cancer[J].Cancer Res, 2008,68(13):5478-5486.

[9] HendrixN D,Wu R,Kuick R,etal.Fibroblast growth factor 9 has oncogenic activity and is a down?stream target of Wnt signaling in ovarian endometri?oid adenocarcinomas[J].Cancer Res,2006,66(3):1354-1362.

[10]Lu K H,Patterson A P,Wang L,et al.Selection of potentialmarkersforepithelialovarian cancerwith gene expression arrays and recursive descent partition analysis[J].Clin Cancer Res,2004,10(10):3291-3300.

[11]Welsh J B,Zarrinkar P P,Sapinoso L M,et al.Anal?ysis of gene expression profiles in normal and neoplas?tic ovarian tissue samples identifies candidate molecu?lar markers of epithelial ovarian cancer[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(3):1176-1181.

[12]Yoshihara K,Tajima A,Komata D,et al.Gene expres?sion profiling of advanced-stage serous ovarian can?cers distinguishes novel subclasses and implicates ZEB2 in tumor pregression and prognosis[J].Cancer Sci,2009,100(8):1421-1428.

[13]宮艷秋,韓鳳娟,吳效科,等.卵巢上皮性癌病因?qū)W研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志,2010,39(5):18-20.

[14]朱秀嫻,章曉樂,傅永倫,等.孕激素抑制LH峰在控制性卵巢刺激過程中的療效觀察[J].生殖與避孕,2015, 35(6):384-388.

[15]陽(yáng)婭玲,肖紅利,管敏鑫.人類線粒體tRNA生物合成與線粒體疾病[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào), 2013,29(10):916-925.

[16]王進(jìn)峰,盧曉明,王禮平,等.基于Oncomine芯片數(shù)據(jù)庫(kù)薈萃分析碳酸苷酶IX在腎細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代泌尿生殖腫瘤雜志,2015,7(4):231-235.

[17]Szasz A M,Lanczky A,Nagy A,et al.Cross-valida?tion of survival associated biomarkers in gastric can?cer using transcriptomic data of 1065 patients[J].Onco?target,2016,7(31):49322-49333.

[18]Ocana A,Perez-Pena J,Alcaraz-Sanabria A,et al.In silico analyses identify gene-sets,associated with clini?cal outcome in ovarian cancer:role of mitotic kinases [J].Oncotarget,2016,7(16):22865-22872.