Ku70基因穩(wěn)定敲除HeLa細胞株的建立及其生物學(xué)功能研究

李達，沈雪蓮，李少華，丁紅梅，李慧，黃皚雪，耿介，王超男，白琛俊，張?zhí)梗瓭?，邵寧?/p>

軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事認知與腦科學(xué)研究所，北京 100850

Ku蛋白是一種含量豐富的核蛋白，進化上高度保守，分布廣泛，從細菌到人類均有表達[1-2]。人Ku蛋白是異二聚體，由Ku70和Ku80兩個亞基組成。研究發(fā)現(xiàn)，Ku蛋白具有不同尋常的DNA結(jié)合特性，其以非序列依賴性的方式緊密結(jié)合在雙鏈DNA的斷端，是經(jīng)典非同源末端連接（classi?cal non-homologous end joining，C-NHEJ）途徑中的DNA末端結(jié)合因子，招募DNA依賴的蛋白激酶催化亞基（DNA-PKcs）與其結(jié)合形成DNA依賴的蛋白激酶全酶，催化雙鏈斷裂DNA的修復(fù)[2-7]。

此外，Ku蛋白還可能參與其他重要的生物學(xué)過程，比如Ku蛋白被證實與染色體端粒結(jié)構(gòu)的維持有密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)在失去任意一個Ku蛋白亞基后，釀酒酵母就會出現(xiàn)端粒結(jié)構(gòu)缺失的現(xiàn)象[8-9]。還有研究顯示Ku70與細胞凋亡有直接聯(lián)系，即Ku70能夠與促凋亡因子Bax結(jié)合，抑制其促進細胞凋亡的作用[10]。然而，Ku蛋白的生物學(xué)功能尚未得到完全闡釋，有待深入研究。

我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)破壞HeLa細胞Ku70基因開放讀框，同時在其中插入潮霉素B抗性基因，然后通過潮霉素B抗性篩選獲得Ku70基因穩(wěn)定敲除的HeLa細胞株，再進一步利用此細胞株研究Ku70蛋白的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細胞由本實驗室保存；pCas-guide和pSilencer2.1-U6hygro質(zhì)粒由軍事醫(yī)學(xué)研究院鄭曉飛教授惠贈；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、T4DNA連接酶、細胞基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；PCR平末端產(chǎn)物加A試劑盒、pBackZero-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；pfuDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)公司；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、BsmBⅠ為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；PRIME jet轉(zhuǎn)染試劑為PolyPlus公司產(chǎn)品；潮霉素B為Roche公司產(chǎn)品；Ku70抗體購自Pro?teintech公司；GAPDH抗體購自中杉金橋公司；CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；2×SYBR Green Mix購自Toyobo公司；引物由生工生物技術(shù)公司合成。

1.2 構(gòu)建pCas-gRNA質(zhì)粒

用CRISPR DESIGN程序設(shè)計針對人Ku70基因的向?qū)NA（guide RNA，gRNA）序列（表1），合成編碼gRNA的DNA序列，退火形成雙鏈DNA。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、BsmBⅠ對pCas-guide載體和退火產(chǎn)物進行雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物。將酶切后的pCas-guide載體和退火產(chǎn)物用T4DNA連接酶于20℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，涂布于氨芐西林（Amp）抗性的細菌培養(yǎng)板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取細菌單克隆，菌液PCR鑒定后選取陽性克隆測序。

表1 合成的引物序列

1.3 構(gòu)建供體DNA質(zhì)粒pBackZero-T-Ku70

以HeLa細胞基因組為模板，Ku70-F1/Ku70-R1為引物擴增Ku70左同源臂片段Ku70-L，以Ku70-F2/Ku70-R2為引物擴增Ku70右同源臂片段Ku70-R；以pSilencer2.1-U6hygro質(zhì)粒為模板，Hy-F/Hy-R為引物擴增潮霉素B抗性基因片段Hy；瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收片段Ku70-L、Ku70-R和Hy。以片段Ku70-L、Hy為模板，Ku70-F1/Hy-R為引物，重疊PCR擴增出Ku70-LHy；再以Ku70-L-Hy和Ku70-R為模板，Ku70-F1/ Ku70-R2為引物，擴增獲得片段Ku70-KO，回收目的片段。用A-Tailing Kit在Ku70-KO片段平末端添加單個堿基A后，將該片段連接到pBackZero-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α并挑取單克隆菌株進行菌液PCR鑒定，選取陽性克隆測序。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染、抗性篩選與鑒定

將HeLa細胞以3×105/mL的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，細胞生長至30%～40%時轉(zhuǎn)染0.8 μg pCas-gRNA質(zhì)粒和1.2 μg pBackZero-T-Ku70質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后72 h收集細胞，以4×104/mL的密度接種至6孔板中，待細胞完全貼壁后加入潮霉素B（200 μg/mL），2～3 d更換一次含同濃度潮霉素B的新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第7 d提取細胞基因組做PCR鑒定。以提取的細胞基因組為模板，Ku70左同源臂基因上的引物K-F和潮霉素B抗性基因上的引物K-R進行PCR擴增。之后將細胞擴大培養(yǎng)，凍存。

1.5 單克隆穩(wěn)定細胞株篩選與鑒定

用有限稀釋法篩選Ku70穩(wěn)定敲除的HeLa單克隆細胞株，胰酶消化細胞，以新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度至10/mL，將稀釋的細胞懸液接種至96孔板，100 μL/孔，培養(yǎng)1周后顯微鏡下觀察，選取含單克隆細胞的孔進行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)至24孔板時改用含200 μg/mL潮霉素B的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，1周后收集細胞進行Western印跡鑒定。

1.6 Western免疫印跡實驗

收集細胞，用RIPA提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量，行12%SDS-PAGE，每泳道35 μg蛋白，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗室溫孵育2 h，0.1%TBS-T洗3次；二抗室溫孵育1 h，0.1%TBS-T洗3次；ECL曝光顯影。

1.7 CCK-8法測定Ku70穩(wěn)定敲除細胞株的增殖能力

將處于對數(shù)生長期的Ku70穩(wěn)定敲除細胞和野生型HeLa細胞以3×104/mL的密度接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，分別在0、24、48、72、96 h加入CCK8試劑，每孔10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后檢測D450nm值，制作細胞的96 h生長曲線。

1.8 Transwell方法檢測Ku70穩(wěn)定敲除細胞株的遷移能力

將處于對數(shù)生長期的Ku70穩(wěn)定敲除細胞和野生型HeLa細胞以2×105/mL的密度種于Tran?swell小室的上室，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h后擦去未穿膜的細胞，用4%多聚甲醛固定穿膜細胞，0.1%結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 Ku70穩(wěn)定敲除細胞的miRNA表達水平檢測

用TRIzol法提取Ku70穩(wěn)定敲除細胞和野生型HeLa細胞的總RNA，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qPCR反應(yīng)體系包括1 μL cDNA、1 μL引物（表1）、10 μL 2×qPCR SYBR Green mix、8 μL ddH2O。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min，變性95℃ 20 s，退火55℃ 20 s，延伸72℃ 20 s，50個循環(huán)，采集熔解曲線。用 StrataGene公司的Mx3000P qPCR儀檢測，Mx3000P軟件分析結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以x±s表示，統(tǒng)計分析使用SAS 9.2軟件的Student'sttest，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 設(shè)計并構(gòu)建pCas-gRNA質(zhì)粒

用 CRISPR DESIGN程 序（http://crispr.mit. edu/）設(shè)計gRNA序列。選取Ku70編碼區(qū)100～300 bp序列輸入對話框，從輸出的結(jié)果中選擇合適的靶位點序列。為了防止脫靶，我們共設(shè)計了3條gRNA序列。將合成的gRNA互補鏈退火形成雙鏈，與雙酶切的線性化pCas-guide連接，獲得重組質(zhì)粒pCas-gRNA。轉(zhuǎn)化鋪板后挑取單克隆菌落進行PCR鑒定，將陽性克隆測序（圖1），結(jié)果顯示3條gRNA序列均正確插入pCas-guide載體，pCasgRNA質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 pCas-gRNA質(zhì)粒菌液PCR鑒定M：DNA marker；1～10：單克隆

2.2 構(gòu)建供體DNA質(zhì)粒pBackZero-T-Ku70

以HeLa細胞基因組為模板，分別以Ku70-F1/ Ku70-R1、Ku70-F2/Ku70-R2為引物，擴增長度分別為500和540 bp的Ku70左右同源臂Ku70-L、Ku70-R；以質(zhì)粒pSilence2.1-U6 hygro為模板，Hy-F/Hy-R為引物，擴增長度為1026 bp的潮霉素抗性基因片段Hy；進而，以DNA片段Ku70-L、Hy為模板，Ku70-F1和Hy-R為引物，利用搭橋PCR擴增片段Ku70-L-Hy；再以Ku70-L-Hy和Ku70-R為模板，Ku70-F1和Ku70-R2為引物，擴增獲得2066 bp的Ku70同源臂供體DNA片段Ku70-KO。瓊脂糖凝膠切膠回收PCR產(chǎn)物中的目的片段，在其末端添加單個堿基A，再將該片段連接到pBackZero-T載體上，菌液PCR鑒定重組菌，將陽性克隆測序（圖2），序列比對結(jié)果表明重組質(zhì)粒序列正確，同源臂供體DNA載體pBackZero-TKu70構(gòu)建成功。

圖2 pBackZero-T-Ku70質(zhì)粒菌液PCR鑒定M：DNA marker；1～10：單克隆

2.3 篩選鑒定Ku70敲除的多克隆細胞株

將重組質(zhì)粒pBackZero-T-Ku70分別與3種pCas-gRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa細胞，72 h后加入終濃度為200 μg/mL的潮霉素進行抗性篩選，15 d后收集細胞，提取細胞總蛋白，Western印跡檢測Ku70蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，與對照細胞相比，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCas-gRNA3的細胞Ku70條帶明顯減弱，提示gRNA3敲除效果最佳（圖3）。

圖3 Western印跡檢測多克隆細胞株中Ku70的表達1：未轉(zhuǎn)染的對照細胞；2：pBackZero-T-Ku70載體和pCas-gRNA1載體共轉(zhuǎn)染的細胞；3：pBackZero-T-Ku70載體和pCas-gRNA2載體共轉(zhuǎn)染的細胞；4～7：pBackZero-T-Ku70載體和pCas-gRNA3載體共轉(zhuǎn)染的細胞

2.4 Ku70敲除細胞的基因組PCR鑒定

提取細胞基因組DNA，以K-F/K-R為引物進行PCR鑒定，結(jié)果見圖4，共轉(zhuǎn)染載體pBackZero-T-Ku70和pCas-gRNA3的細胞基因組DNA，經(jīng)PCR擴增后在800 bp左右出現(xiàn)目的條帶，而未轉(zhuǎn)染的對照細胞沒有此條帶，表明潮霉素B抗性基因正確插入Ku70基因的特定位點。

圖4 基因組PCR鑒定敲除Ku70基因的單克隆細胞株1，2：共轉(zhuǎn)染pBackZero-T-Ku70和pCas-gRNA3的細胞；NC：未轉(zhuǎn)染的細胞

圖5 敲除Ku70基因的單克隆細胞株Western印跡鑒定NC：野生型HeLa細胞；1～18：單克隆HeLa細胞株

2.5 分離并鑒定Ku70穩(wěn)定敲除的單克隆細胞株

用有限稀釋法篩選Ku70穩(wěn)定敲除的HeLa單克隆細胞株。將細胞接種至96孔板，培養(yǎng)1周后選取單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)，繼而收集細胞，提取細胞提取總蛋白進行Western印跡鑒定（圖5）。本次實驗共獲得18株細胞，其中14號和18號2株為敲除Ku70的單克隆細胞株。

2.6 敲除Ku70基因的穩(wěn)定細胞株生物學(xué)功能檢測

2.6.1 細胞增殖實驗 用CCK-8法檢測敲除Ku70基因的18號細胞株的增殖能力，得到18號Ku70穩(wěn)定敲除細胞（KO）和野生型HeLa細胞（WT）的生長曲線（圖6），與野生型比較，敲除Ku70基因的HeLa細胞增殖能力明顯減弱。

2.6.2 細胞遷移實驗 用Transwell方法檢測18號細胞株的遷移能力，顯微鏡下觀察并拍照（圖7A）；分別統(tǒng)計實驗組和對照組穿膜的HeLa細胞數(shù)，并進行統(tǒng)計學(xué)分析（圖7B）。實驗結(jié)果表明，與野生型細胞相比，敲除Ku70基因的HeLa細胞遷移能力明顯減弱。

2.6.3 實時熒光定量PCR分析敲除Ku70基因后HeLa細胞5種miRNA的表達水平 用TRIzol法提取HeLa細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用qPCR儀檢測5種miRNA的表達水平。結(jié)果見圖8，與WT比較，敲除Ku70基因后hsa-miR-649、hsa-miR-562、hsa-miR-544a的表達水平顯著上調(diào)，hsamiR-548a、hsa-miR-492水平?jīng)]有顯著變化。

圖6 Ku70基因穩(wěn)定敲除細胞株生長曲線（n=3）WT：野生型HeLa細胞；KO：Ku70穩(wěn)定敲除細胞；*P＜0.05，***P＜0.001

3 討論

作為C-NHEJ途徑中的重要因子，Ku蛋白的DNA斷裂修復(fù)功能已經(jīng)有了較為詳盡的研究報道。與DNA斷裂修復(fù)功能類似，Ku蛋白還在保持染色體端粒結(jié)構(gòu)的完整性方面發(fā)揮重要作用。在酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，Ku蛋白能夠通過結(jié)合端粒酶RNA元件TLC1的48 nt頸環(huán)結(jié)構(gòu)，協(xié)助招募端粒酶，完成端粒的延伸[11-12]。但隨后又有研究表明，人Ku蛋白能夠結(jié)合端粒酶47 nt的RNA元件hTR，而hTR與TLC1并沒有相似序列[13]。Ku70還被證實能夠通過結(jié)合細胞凋亡促進因子Bax，抑制細胞凋亡。在個體水平上，Ku蛋白還被證實與衰老有關(guān)。單獨敲除Ku70或Ku80，或者二者都敲除的小鼠，均出現(xiàn)了類似的加速衰老現(xiàn)象[14]。猜測這可能與影響了C-NHEJ途徑有關(guān)，因為衰老的大鼠神經(jīng)元細胞內(nèi)和阿爾茲海默患者腦組織內(nèi)的C-NHEJ途徑均明顯減弱。缺失了Ku蛋白的作用后，C-NHEJ途徑將進一步減弱，這或許最終導(dǎo)致細胞和個體衰老加速[15-16]。這些研?究結(jié)果提示，Ku蛋白的生物學(xué)功能十分廣泛，還需要進一步挖掘。

圖7 Ku70基因穩(wěn)定敲除細胞株遷移能力檢測（n=3）WT：野生型HeLa細胞；KO：Ku70穩(wěn)定敲除細胞；**P＜0.01

圖8 qPCR檢測敲除Ku70后HeLa細胞5種miRNA的表達水平（n=3）WT：野生型HeLa細胞；KO：Ku70穩(wěn)定敲除細胞；**P＜0.01，***P＜0.001

Ku蛋白結(jié)合DNA的特異性早已確定，并且已經(jīng)有研究證明Ku蛋白與DNA的結(jié)合并不是依賴特定序列或堿基的[17]。生物化學(xué)分析結(jié)果顯示，Ku70亞基的3個結(jié)構(gòu)域（ɑ/β結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Ku80結(jié)合結(jié)構(gòu)域）對于Ku蛋白聚集在雙鏈斷裂DNA末端是必需的[18]。細胞實驗表明Ku70蛋白能夠作為細胞內(nèi)的模式受體識別外來的病毒DNA，進而介導(dǎo)Ⅲ型干擾素的產(chǎn)生[19]。此外，Ku蛋白的RNA結(jié)合特異性也被證實。比如上面提到的Ku蛋白在維持端粒結(jié)構(gòu)的過程中，就發(fā)揮了招募端粒酶RNA元件的功能。有報道稱Ku70蛋白能夠與一類具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)并且?guī)в幸粋€突出基序的RNA特異結(jié)合，這表明Ku70與RNA的結(jié)合是空間特異性的[20-21]。

為了便于深入研究Ku70蛋白的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了Ku70基因穩(wěn)定敲除的HeLa細胞株，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。我們檢測了Ku70穩(wěn)定敲除細胞株的增殖和遷移能力等生物學(xué)功能，結(jié)果表明敲除Ku70基因后HeLa細胞增殖和遷移能力均有所減弱，提示Ku70可能參與了HeLa細胞的增殖和遷移過程。此外，我們前期的實驗結(jié)果提示Ku70蛋白可能調(diào)節(jié)miRNA表達（結(jié)果未顯示），而本研究中，我們嘗試檢測Ku70穩(wěn)定敲除細胞株中幾種可能被Ku70蛋白調(diào)節(jié)的miRNA表達水平。RT-qPCR結(jié)果顯示，3種miRNA在敲除Ku70基因的HeLa細胞中明顯上調(diào)，提示Ku70可能參與了這些miRNA的表達調(diào)控，相關(guān)的分子機制還有待進一步研究。

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