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    地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌SC-1原生質(zhì)體制備與再生條件的研究

    2018-04-09 05:47:13陳切希簡(jiǎn)志青賈冬英遲原龍
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年5期
    關(guān)鍵詞:原生質(zhì)溶菌酶甘氨酸

    陳切希, 簡(jiǎn)志青, 賈冬英, 遲原龍, 姚 開

    (1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065; 2.元智大學(xué)生物工程與科技研究所,臺(tái)灣桃園 32003)

    近年來,隨著人類對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的需求量不斷增大,農(nóng)藥的使用量也呈不斷上升趨勢(shì),然而長(zhǎng)期使用造成了農(nóng)畜產(chǎn)品和土壤中農(nóng)藥的殘留量超標(biāo)。β-氯氰菊酯是一種重要的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,廣泛施用可能導(dǎo)致環(huán)境中殘留量超標(biāo),直接或間接對(duì)人類健康造成威脅[1-2]。微生物降解法具有安全、環(huán)保、無二次污染等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品以及土壤中農(nóng)藥的降解。目前,具有轉(zhuǎn)化效率高的微生物已被應(yīng)用于環(huán)境或農(nóng)作物土壤中殘留農(nóng)藥的降解[3],然而多數(shù)菌株只能將β-氯氰菊酯(β-CY)降解為3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)[4]。原生質(zhì)體融合技術(shù)是工業(yè)上微生物育種的一種重要手段,可以在種間、屬間以及跨界融合[5]。原生質(zhì)體制備和再生是其融合過程非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié),直接決定育種的效率[6]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期從污染土壤中分離到地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌SC-1,前者可以將β-CY降解為3-PBA,后者可以將 3-PBA 繼續(xù)降解[7]。吳雙研究表明,制備的菌株B-1和菌株SC-1可濕性粉劑可以修復(fù)β-CY污染的土壤,有效降低小白菜中β-CY殘留[8]。本研究探討了地衣芽孢桿菌 B-1 和鞘氨醇單胞菌SC-1的原生質(zhì)體制備和再生條件,以期為通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育β-CY和3-PBA高效降解菌奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1)為實(shí)驗(yàn)室前期從茶園土壤分離馴化并保存的菌種,適宜條件下對(duì)β-CY 降解率為94.12%。鞘氨醇單胞菌SC-1(Sphingomonassp. SC-1)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室前期從農(nóng)藥廠排污渠下游土壤中分離并保存的菌種,可以礦化降解 3-PBA。

    β-CY原藥(含量96.8%,榮城化工公司),3-PBA標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%,梯希愛化成工業(yè)有限公司),溶菌酶(100 000 U/mg,Sigma公司),酸水解酪蛋白、胰蛋白胨、酵母膏、瓊脂(BD公司),蔗糖、葡萄糖、順丁烯二酸、琥珀酸鈉、甘露醇、青霉素、甘氨酸、BSA(Sigma公司),其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母膏5.0 g,NaCl 10 g,去離子水1 000 mL,pH值7.0,吐溫80 2.0 mL,121 ℃滅菌 20 min;LB瓊脂培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基中加入瓊脂18 g和定量β-CY 或3-PBA工作液,使其濃度為100 mg/L,121 ℃滅菌20 min;再生培養(yǎng)基DM3:參照文獻(xiàn)[9]制備,用于菌株B-1原生質(zhì)體的再生;再生培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母膏5.0 g,NaCl 10 g,蔗糖171 g,去離子水1 000 mL,pH值7.0,吐溫80 2.0 mL,121 ℃滅菌20 min,用于菌株SC-1原生質(zhì)體再生;原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM):0.5 mol/L蔗糖,0.02 mol/L MgCl2,0.02 mol/L順丁烯二酸,pH值6.5,121 ℃滅菌20 min;Tris-HCl緩沖液:Tris-HCl 0.01 mol/L,pH值8.0,121 ℃滅菌 20 min;EDTA溶液:EDTA 0.1 mol/L,用KOH溶液調(diào)pH值至 8.0,121 ℃滅菌20 min;溶菌酶液:用SMM溶液分別配制溶菌酶濃度為2.0 mg/mL和10 mg/mL溶液,0.22 μm膜過濾除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    SP-830 PLUS可見光分光光度計(jì)(Metertech公司),UB-10 精密酸度計(jì)(Denver公司),Axiostar Plus光學(xué)顯微鏡(Zeiss公司),CF16RXII高速冷凍離心機(jī)(Hitachi公司)。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1菌株B-1和菌株SC-1生長(zhǎng)曲線繪制將菌株 B-1 和菌株SC-1分別劃線接種于β-CY或3-PBA濃度為100 mg/L的LB瓊脂斜面培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)48 h,無菌生理鹽水洗下菌苔,混勻,按5.0%體積比例接入β-CY或 3-PBA 濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基,30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣,測(cè)其吸光度D600 nm,以培養(yǎng)時(shí)間對(duì)D600 nm作圖。

    1.2.2菌株B-1原生質(zhì)體的制備和再生按5.0%的體積比例將菌株B-1接入β-CY濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。SMM洗滌菌體2次,離心(4 ℃,8 000 r/min)10 min,SMM重懸并調(diào)其D600 nm為1.2,取少量適當(dāng)稀釋后涂布于LB平板,30 ℃培養(yǎng) 24~48 h,菌落數(shù)記為A;余下的菌懸液中加入不同濃度的溶菌酶液,37 ℃振蕩(100 r/min)30 min,離心(4 ℃,4 000 r/min)10 min,沉淀重懸于SMM,涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基DM3,30 ℃培養(yǎng)24~48 h,菌落數(shù)分別記為B(未被除壁的菌體細(xì)胞)和C(再生菌體細(xì)胞),按下式計(jì)算菌株B-1原生質(zhì)體的形成率和再生率[10]:

    形成率=(A-B)/A×100%;

    再生率=(C-B)/(A-B)×100%。

    1.2.3菌株SC-1原生質(zhì)體的制備和再生按5.0%的體積比例將菌株SC-1接種于3-PBA濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基,30 ℃振蕩(180 r/min)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。Tris-HCl緩沖液洗滌菌體2次,離心(4 ℃,12 000 r/min)10 min,Tris-HCl緩沖液重懸并調(diào)D600 nm為1.4,加入EDTA溶液,使其終濃度為10 mmol/L,37 ℃振蕩(100 r/min)20 min。SMM洗滌菌體2次,重懸于SMM,加入溶菌酶溶液,37 ℃振蕩(100 r/min)15 min,離心(4 ℃,4 000 r/min)10 min,沉淀重懸于SMM[11,12]。SMM梯度稀釋,涂布于再生培養(yǎng)基,30 ℃培養(yǎng)96~120 h。菌株SC-1原生質(zhì)體的形成率和再生率計(jì)算方法同“1.3.2”節(jié)。

    1.2.4影響菌株原生質(zhì)體形成和再生的因素

    1.2.4.1甘氨酸和青霉素對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響分別在菌株B-1和菌株SC-1生長(zhǎng)延滯期加入甘氨酸(終濃度為1.0 mg/mL)或在生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期中期加入青霉素(終濃度為2.5 U/mL),測(cè)定并計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

    1.2.4.2溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響當(dāng)菌株B-1生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)末期時(shí)(13 h),分別用不同濃度的溶菌酶作用15 min;當(dāng)菌株SC-1生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)末期(12 h)時(shí),EDTA預(yù)處理,分別用不同濃度的溶菌酶作用20 min;測(cè)定并計(jì)算原生質(zhì)體的形成率和再生率。

    1.2.4.3溶菌酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響用溶菌酶分別對(duì)菌株 B-1 和菌株SC-1作用不同時(shí)間,測(cè)定原生質(zhì)體的形成率和再生率。

    1.2.4.4EDTA濃度對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響分別用不同濃度的EDTA溶液對(duì)菌株SC-1進(jìn)行預(yù)處理,測(cè)定并計(jì)算原生質(zhì)體形成率與再生率。

    1.2.4.5穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響考察相同濃度(0.5 mol/L)穩(wěn)定劑(琥珀酸鈉、蔗糖、氯化鈉、甘露醇)的再生培養(yǎng)基分別對(duì)菌株B-1和菌株SC-1再生率的影響。

    1.2.4.6原生質(zhì)體制備和再生適宜條件的確定基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)原生質(zhì)體制備和再生的適宜條件進(jìn)行試驗(yàn)確認(rèn)。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    所有試驗(yàn)平行重復(fù)3次,使用軟件Origin 9.0和Excel 2017對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株B-1和菌株SC-1的生長(zhǎng)曲線

    菌株B-1和菌株SC-1的生長(zhǎng)曲線如圖1和圖2所示。可以看出,菌株B-1的延滯期為8 h,16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期;菌株SC-1經(jīng)過2 h的延滯期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,18 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。對(duì)數(shù)期菌體的生理狀態(tài)相對(duì)一致,代謝旺盛,對(duì)溶菌酶的敏感性強(qiáng),有利于原生質(zhì)體形成和再生,對(duì)數(shù)期末菌體數(shù)最多,方便收集[13],因此菌株B-1和菌株SC-1菌齡分別是13 h和12 h。

    2.2 影響原生質(zhì)體形成和再生的因素

    2.2.1甘氨酸和青霉素對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響甘氨酸是細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)類似物,可能摻入細(xì)胞壁中,擾亂肽聚糖的相互交聯(lián),導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的不完整,不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)[13]。青霉素可能與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合,抑制其側(cè)鏈末端的丙氨酸與五肽橋的連接,影響轉(zhuǎn)肽作用與肽鍵的形成,所以增強(qiáng)菌體對(duì)溶菌酶的敏感性,有利于細(xì)胞原生質(zhì)體的形成[14]。表1結(jié)果表明,2個(gè)菌株的培養(yǎng)過程中分別加入甘氨酸或青霉素的原生質(zhì)體形成率雖然略有提高,但是原生質(zhì)體的再生率顯著降低。

    表1 甘氨酸和青霉素對(duì)菌株原生質(zhì)體形成和再生的影響

    2.2.2溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響由圖3可以看出,2個(gè)菌株原生質(zhì)體形成率均隨溶菌酶濃度的增加而提高,而再生率呈下降趨勢(shì);當(dāng)溶菌酶濃度為0.1 mg/mL 時(shí),菌株B-1的原生質(zhì)體形成率(90%)和再生率(4.61%)較高;當(dāng)溶菌酶濃度為3.33 mg/mL時(shí),菌株SC-1的形成率(90.2%)和再生率(13.73%)較高;當(dāng)酶濃度繼續(xù)增加,2個(gè)菌株的原生質(zhì)體形成率提高不明顯, 但原生質(zhì)體再生率顯著下降。因?yàn)槿芫该附饧?xì)胞壁的原因是它可以破壞細(xì)胞壁肽聚糖的β-1,4糖苷鍵,濃度越高破壞效果越明顯,易導(dǎo)致脫壁過度,使其失去再生細(xì)胞壁的引物[13-14],所以當(dāng)其濃度過高時(shí),再生率顯著降低。

    2.2.3溶菌酶作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響由圖4可以看出,初始階段菌株B-1和菌株SC-1原生質(zhì)體形成率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)迅速提高,15 min后提高緩慢,而再生率隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。溶菌酶作用時(shí)間短,原生質(zhì)體表面的細(xì)胞壁碎片較多,可作為細(xì)胞壁再生的引物,但作用時(shí)間過長(zhǎng),菌體細(xì)胞壁碎片被全部酶解,而且原生質(zhì)體容易受損,導(dǎo)致其再生困難[15]。

    2.2.4EDTA濃度對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響由圖5可以看出,隨著EDTA濃度增加,菌株SC-1的原生質(zhì)體形成率提高,而再生率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。以原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積最大作為判斷原生質(zhì)體制備條件的依據(jù)[16],EDTA預(yù)處理的適宜濃度為5 mmol/L。EDTA對(duì)菌株SC-1進(jìn)行預(yù)處理可明顯提高原生質(zhì)體的形成率,因?yàn)镋DTA可以通過螯合作用破壞菌株SC-1細(xì)胞壁的外膜,有利于溶菌酶與肽聚糖的接觸,提高原生質(zhì)體的形成率,但是EDTA對(duì)原生質(zhì)體具有毒害作用,隨著作用時(shí)間延長(zhǎng),原生質(zhì)體的再生率下降[11]。

    2.2.5穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體形成和再生的影響由表2可以看出,琥珀酸鈉是菌株B-1原生質(zhì)體再生的較理想穩(wěn)定劑,其再生率(6.82%)最高;蔗糖是菌株SC-1原生質(zhì)體再生的較理想穩(wěn)定劑,再生率(26.54%)最高。穩(wěn)定劑一方面可以調(diào)節(jié)滲透壓維持原生質(zhì)體的穩(wěn)定有利于再生,另一方面原生質(zhì)體可能會(huì)利用穩(wěn)定劑代謝產(chǎn)酸,導(dǎo)致再生培養(yǎng)基的pH值下降,不利于原生質(zhì)體的再生,選擇合適的穩(wěn)定劑對(duì)原生質(zhì)體的再生至關(guān)重要。

    2.2.6原生質(zhì)體制備適宜條件的驗(yàn)證基于單因素試驗(yàn)結(jié)果,確定菌株B-1原生質(zhì)體制備的適宜條件為:菌齡13 h,溶菌酶濃度0.1 mg/mL,溶菌酶作用時(shí)間15 min;菌株SC-1原生質(zhì)體制備的適宜條件為:菌齡12 h,EDTA濃度 5 mmol/L,溶菌酶濃度3.33 mg/mL,溶菌酶作用時(shí)間15 min。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示,菌株B-1原生質(zhì)體形成率為93.11%,再生率為7.22%;菌株SC-1原生質(zhì)體形成率為95.37%,再生率為27.04%。2個(gè)菌株原生質(zhì)體制備前后的顯微鏡圖像如圖6和圖7所示??梢钥闯?,長(zhǎng)桿狀的菌株B-1細(xì)胞和短桿狀的菌株SC-1細(xì)胞多數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)榍蛐巍?/p>

    表2 穩(wěn)定劑對(duì)菌株B-1和菌株SC-1原生質(zhì)體再生的影響

    3 結(jié)論

    原生質(zhì)體制備是原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵技術(shù)之一,要制備有活性且大量的原生質(zhì)體,需要對(duì)不同菌株進(jìn)行合適的處理。本研究對(duì)分離得到的地衣芽孢桿菌B-1和鞘氨醇單胞菌 SC-1 原生質(zhì)體進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)菌齡、溶菌酶濃度及作用時(shí)間等因素對(duì)原生質(zhì)體的形成和再生影響明顯。本研究獲得了具有活性的原生質(zhì)體,適宜條件下菌株B-1和菌株SC-1的原生質(zhì)體形成率和再生率均較高,為后續(xù)通過原生質(zhì)體融合技術(shù)選育β-CY高效降解菌奠定了基礎(chǔ)。

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