小鼠毛囊發(fā)育中細胞增殖區(qū)及干細胞巢的形成演化

王洪陽　王海濤　李樹偉

843300新疆阿拉爾，塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室

毛囊干細胞巢［1］的生物學(xué)功能探究是目前干細胞研究較為熱門的方向，研究者已將其定位在毛囊隆突部位［2］，且發(fā)現(xiàn)毛囊隆突部細胞具有修復(fù)創(chuàng)面及再生皮膚的功能［3］。但是毛囊干細胞巢的形成機制與過程尚不明確。干細胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2作為Sox B1家族的重要一員，主要調(diào)控干細胞發(fā)育及決定干細胞分化方向，尤其在維持干細胞多能性方面具有重要作用［4?5］，其表達是保證干細胞處于未分化狀態(tài)的重要條件之一［6］。我們在EdU標記后進行免疫染色，檢測小鼠毛囊細胞增殖活躍區(qū)，并針對Sox2進行免疫熒光染色，定位不同發(fā)育階段毛囊Sox2表達區(qū)域，追蹤定位毛囊干細胞巢祖細胞來源，初步演化毛囊隆突部的形成過程。

圖1　不同時期觸須毛囊發(fā)育形態(tài)及觸須毛囊結(jié)構(gòu)；1A～1C：出生后第1、7、15天觸須毛囊實物圖；1D：第7天觸須毛囊縱切面結(jié)構(gòu)圖（×100）；1E：第7天觸須毛囊橫切面結(jié)構(gòu)圖（×400）

一、材料

1.小鼠：成年發(fā)情期的SPF級健康昆明（KM）遠交系小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號（軍）：SCXK 2012?0007，批號0014379，雌雄各10只，體重60 ～ 80 g。飼養(yǎng)在潔凈通風(fēng)處，塔里木大學(xué)實驗動物中心定期檢測致病原，以確保新生KM小鼠符合本試驗要求，試驗小鼠均采用SPF級潔凈鼠糧飼養(yǎng)。

2.主要試劑和儀器：KeyFluor488 Click?iT 5-溴-2-脫氧尿嘧啶（EdU）成像檢測試劑盒（KGA331?50，南京凱基生物科技有限公司），一抗兔抗小鼠Sox2蛋白（SC?20088，上海玉博生物科技有限公司），二抗KeyFluor488標記的山羊抗兔IgG（SA00003?2，武漢三鷹生物科技有限公司）。牛血清蛋白（BSA）（美國Gibco公司），抗熒光猝滅劑（北京索萊寶科技有限公司），杜氏磷酸鹽緩沖液（DPBS，北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）。

二、方法

1.觸須毛囊樣品處理：隨機選取剛出生、6 d齡乳小鼠、14 d齡斷乳鼠各2只，雌雄不限，每年齡段小鼠均隨機分成兩組，即標記組和無標記組：標記組小鼠觸須部位皮下注射40 μl用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋的EdU（20 μmol/L）；無標記組小鼠不做任何處理。6只小鼠正常飼養(yǎng)24 h后，均斷頸處死。采用顯微外科解剖法獲取不同日齡小鼠觸須完整毛囊60個/只，PBS清洗干凈，OCT冰凍包埋，液氮速凍1 h，-80℃冰箱冷凍48 h，制作8 μm厚冰凍切片，正電荷防脫載玻片吸附冰凍切片，-20℃冰箱中凍存。

2.常規(guī)病理染色：HE染色毛囊組織切片，晾干，封片，顯微鏡觀察并拍照。

3.毛囊切片EdU標記染色：EdU標記培養(yǎng)的組織切片滴加1 ml 4%多聚甲醛室溫固定30 min，然后3%BSA溶液清洗2次，加入0.5%Triton X?100溶液（混合PBS配制）透化細胞質(zhì)膜和核膜，20 min后，再使用3%BSA溶液清洗2次。每張玻片上加入0.5 ml Click?iT反應(yīng)混合物，室溫避光孵育30 min，同時以PBS代替Click?iT反應(yīng)混合物作為陰性對照。棄去Click?iT反應(yīng)混合物，使用3%BSA溶液漂洗2次，采用抗熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡拍照觀察。

4.毛囊切片Sox2免疫熒光染色：冰凍切片自然晾干30 min，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，使用0.5%Triton X?100透膜20 min，3%BSA和10%山羊血清各250 μl混合滴至冰凍切片，放入濕盒4℃避光孵育1 h，棄孵育液，滴加100 μl一抗兔抗小鼠Sox2蛋白稀釋液，以PBS代替一抗做免疫熒光陰性對照，4℃下濕盒孵育過夜，然后使用PBS漂洗3次，滴加二抗KeyFluor488標記的山羊抗兔IgG。加入細胞核熒光染色劑DAPI，4℃濕盒避光孵育1 h，PBS漂洗3次，棄漂洗液，抗熒光猝滅劑封片。熒光顯微鏡拍照觀察。

三、結(jié)果

1.觸須毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)：對每個日齡無標記小鼠30個毛囊HE染色后顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，同一日齡不同毛囊間形態(tài)結(jié)構(gòu)類似。第1天時（圖1A），觸須毛囊呈灰白色，可以看到毛干，毛球部中可明顯區(qū)分出真皮乳頭；第7天時（圖1B），觸須毛囊毛干變得粗壯，同時毛囊外根鞘上部出現(xiàn)環(huán)周隆突，并且大量毛細血管包繞整個毛囊，但毛球部毛細血管數(shù)沒有毛囊中上部多；第15天時（圖1C），觸須毛囊毛干變得更加粗壯，且每個觸須毛囊不僅伸出1條毛干，同時包繞毛囊的毛細血管更加豐富，但相對于第7天毛囊球部毛細血管依舊沒有出現(xiàn)增多的跡象。從第7天分離出的單獨觸須毛囊的縱切（圖1D）和橫切（圖1E）圖上可以清楚地看到觸須毛囊的各個結(jié)構(gòu)，包括結(jié)締組織鞘、毛囊外根鞘、毛囊內(nèi)根鞘、毛干、毛母質(zhì)、玻璃膜、真皮乳頭。

2.觸須毛囊發(fā)育過程中細胞增殖活躍區(qū)標記：對每個日齡Edu標記小鼠60個毛囊染色后發(fā)現(xiàn)，同一日齡不同毛囊間細胞增殖活躍區(qū)分布一致。見圖2。第1天時，小鼠觸須毛囊細胞的增殖活躍區(qū)在真皮乳頭以及毛母質(zhì)，增殖活躍區(qū)呈現(xiàn)“O”型，毛囊的中上端增殖不明顯，只在毛囊外根鞘上端存在散在增殖毛囊細胞；第7天時真皮乳頭不再是小鼠觸須毛囊細胞增殖活躍區(qū)，毛母質(zhì)依舊是增殖活躍區(qū)，但活躍區(qū)開始向毛球部外根鞘轉(zhuǎn)移，增殖活躍區(qū)呈“∩”型，毛囊中上端細胞增殖依舊不明顯；第15天時，小鼠觸須毛囊細胞增殖活躍區(qū)開始轉(zhuǎn)變成毛球基底部，同時沿著內(nèi)根鞘向上延伸，增殖活躍區(qū)呈現(xiàn)“U”型，同時毛囊中上段細胞增殖明顯（白色箭頭示），陽性細胞信號增多，并在毛囊外根鞘處形成一定的隆起。陰性對照組不顯示增殖活躍區(qū)。

圖2　不同發(fā)育時期觸須毛囊干細胞增殖活躍區(qū)標記　白色虛線內(nèi)部為細胞增殖強活躍區(qū)，白色箭頭示毛囊中上部隆突部旁細胞增殖。ORS：外根鞘；Bulge：隆突部；DP：真皮乳頭

圖3　免疫熒光染色檢測干細胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2在不同發(fā)育時期觸須毛囊中的表達　白色箭頭示Sox2表達區(qū)域；Bulge：隆突部（白色虛線部位）；ORS：外根鞘；IRS：內(nèi)根鞘；GM：玻璃膜；HS：毛干；HM：毛母質(zhì)；DP：真皮乳頭（白色虛線部位）

3.Sox2在觸須毛囊中的表達：對每個日齡無標記小鼠30個毛囊行Sox2染色顯示，同一日齡不同毛囊間Sox2表達相似，見圖3。在出生第1天的小鼠觸須毛囊中，Sox2的表達主要集中在毛囊外根鞘，且在外根鞘的外圍形成一層表達帶。毛囊球部外根鞘細胞中Sox2表達強于其他部位，真皮乳頭部位也有少量Sox2表達。第7天Sox2的表達主要集中在毛囊中上部，且中上部毛囊外根鞘中表達Sox2的細胞增多，表達帶增厚，但毛球部毛囊細胞中Sox2表達減弱。第15天Sox2的表達依舊主要集中在毛囊中上部，且毛囊最上端的外根鞘周圍出現(xiàn)次級毛囊，Sox2在次級毛囊中強陽性表達，毛囊中部外根鞘有隆起，且隆起部中有大量表達Sox2的細胞存在，毛球部毛囊細胞中Sox2表達依舊減弱，且真皮乳頭細胞中沒有檢測到表達Sox2的細胞。陰性對照組觸須毛囊中無Sox2表達。

四、討論

本研究發(fā)現(xiàn)，毛囊隆突部的形成基礎(chǔ)來源于毛囊真皮乳頭，即毛囊毛球部的成纖維細胞，毛球部成纖維細胞的大量增殖及遷移在不同時期的毛囊中顯示出動態(tài)變化，Sox2定位顯示隨著毛囊的成熟，毛囊干細胞增殖能力下降，但是Sox2的表達增多，同時Sox2也主要集中在毛囊隆突部，形成相對封閉的空間，空間內(nèi)細胞大量表達Sox2，但是卻不再增殖，毛囊隆突部細胞進入靜息期，毛囊干細胞不再分化增殖，除非毛囊受損，毛囊啟動修復(fù)再生機制，受損毛囊干細胞巢中干細胞激活后開始增殖、分化，遷移出干細胞巢，分化成受損處的同源細胞，修復(fù)毛囊受損或者皮膚創(chuàng)面［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，毛囊干細胞巢的生成過程中，可能是表皮基底層首先形成毛囊樣結(jié)構(gòu)［8?9］，毛囊發(fā)育過程中形成毛囊毛球部，毛球部中真皮乳頭具有較強的增殖分化功能，真皮乳頭細胞增殖分化出的細胞沿著毛囊外根鞘和內(nèi)根鞘向毛囊上部遷移，集中在毛囊中上部，形成隆突（隆突部中的細胞也被稱為毛囊干細胞），進入不再增殖分化的靜息期。

毛囊隆突部干細胞巢的形成是一復(fù)雜的過程，形成機制涉及皮膚表皮和真皮的相互作用以及毛囊內(nèi)部細胞的自身發(fā)育過程等。另外毛囊隆突部位鎖定在毛囊中上部，離表皮的基底層很近，但同時它又處在皮膚的真皮層中，因此，皮膚受創(chuàng)后，毛囊隆突部干細胞巢中的干細胞可以就近根據(jù)創(chuàng)面的大小與深度增殖遷移,修復(fù)創(chuàng)面，修復(fù)過程中，毛囊隆突部的位置對縮短增殖細胞的遷移距離具有重要作用。

綜上所述，我們初步探索了毛囊隆突部干細胞巢的形成過程，同時也為進一步研究毛囊隆突部干細胞巢中細胞生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。

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