氧化石墨烯修飾再生碳纖維微電極的新方法

程　寒，李　元，李　梅，戴　夢(mèng)，谷　飛，鮑昌昊，黃蓉萍，馬靜芳

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 民族藥學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 中南民族大學(xué)，武漢 430074)

五羥色胺(5-HT)是一種重要的雜環(huán)胺神經(jīng)遞質(zhì)，可參與消化系統(tǒng)、睡眠和體溫等多種生理功能的調(diào)節(jié)[1]，揭示體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)五羥色胺的變化與病理病癥之間的關(guān)系至關(guān)重要[2].在電化學(xué)檢測(cè)中，因5-HT及其氧化活性產(chǎn)物在電極表面存在不同程度的吸附[3]，易形成絕緣膜而降低電極的靈敏度，對(duì)被5-HT毒化的電極進(jìn)行活化非常重要[4].多巴胺是下丘腦和腦垂體腺中的一種關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)，其濃度受精神因素影響，神經(jīng)末梢的促性腺激素釋放激素(GnRH)和多巴胺間存在著軸突聯(lián)系并相互作用，多巴胺有抑制GnRH分泌的作用[5].目前，多巴胺常見的檢測(cè)方法有分光光度法、液相色譜法、熒光法、極譜法、伏安法和電化學(xué)法[6].其中電化學(xué)法測(cè)定多巴胺具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、儀器價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn).

碳材料是地球上一種非常重要的導(dǎo)電材料，它不僅能形成非常堅(jiān)硬的金剛石，還能形成非常軟的石墨烯.2004年Geim等[7,8]首次用機(jī)械剝離法發(fā)現(xiàn)了新型碳材料——石墨烯，它僅有單原子厚度，是世界上最薄的材料[9]，被認(rèn)為是富勒烯、碳納米管(CNT)、石墨的基本單元結(jié)構(gòu)[10]，具有優(yōu)良的導(dǎo)電性能[11]和永不消失的導(dǎo)電率[12]及成本低廉等，在電子、信息、能源、材料和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[13].氧化石墨烯是石墨烯的重要衍生物，由于其在單層碳原子構(gòu)成的二維空間無(wú)限延伸的表面含有大量可修飾的基團(tuán)[14]，它具有優(yōu)越的吸附性能，能與許多金屬和金屬氧化物復(fù)合得到性能優(yōu)異的復(fù)合材料[15].用氧化石墨烯修飾電極可使用滴涂法[16]和電沉積法，與滴涂法相比，電沉積法是一種較為新穎的修飾石墨烯的方法[17]，它在相對(duì)簡(jiǎn)單的條件下可獲得直徑小、靈敏度高的電極[18].

本實(shí)驗(yàn)采用電沉積法在被5-HT毒化的電極表面修飾氧化石墨烯導(dǎo)電層，使被毒化的碳纖維電極的電化學(xué)性能再生，并優(yōu)化了電沉積電壓和時(shí)間，考查了再生電極的穩(wěn)定性，并對(duì)活化后的碳纖維電極進(jìn)行了電化學(xué)性能研究，證明該再生電極對(duì)多巴胺具有良好的電化學(xué)響應(yīng).

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　試劑和儀器

碳纖維(直徑6 μm，吉林市神舟碳纖維有限責(zé)任公司)，石墨烯水分散液(0.5 mg/mL，XF NANO)，無(wú)水乙醇(分析純，天津醫(yī)藥公司)，多巴胺(DA,Sigma)，去甲腎上腺素(NE,Sigma)，抗壞血酸(AA, 分析純, 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，DA, NE, AA均用無(wú)水乙醇作為溶劑配成10 mmol/L的母液備用. 五羥色胺(5-HT, Sigma)，用0.1 mol/L的HClO4配置成1 mmol/L的母液，置于4 ℃的冰箱冷藏室中保存，使用時(shí)用Tris-HCl緩沖溶液稀釋到所需的濃度. 碳粉導(dǎo)電膠(自制)，AB膠(廣東愛必達(dá)膠黏劑有限公司)，實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水.

倒置顯微鏡(XD-RFL,寧波舜宇儀器)，化學(xué)工作站(CHI660D,上海辰華)，酸度計(jì)(FE20K型,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán))，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用雙電極系統(tǒng)：碳纖維微電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極.

1.2　碳纖維微電極的制作

在酒精燈火焰上拉制玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑1 mm)，使其尖端內(nèi)徑約20 μm，碳纖維(直徑6 μm，長(zhǎng)約15 mm)和銅絲(直徑0.2 mm，長(zhǎng)約10 cm)用碳粉導(dǎo)電膠粘連，將碳纖維從玻璃毛細(xì)管另一端穿入至露出玻璃毛細(xì)管尖端外約2 mm，用AB膠將玻璃毛細(xì)管末端封住，粘膠固化后固定銅絲，再將玻璃毛細(xì)管尖端置于酒精燈外焰約0.5 s，玻璃迅速熔封，露出的碳纖維在酒精燈外焰上小心燒蝕，在倒置顯微鏡下測(cè)量電極長(zhǎng)度，至露出的碳纖維長(zhǎng)度100～200 μm即為碳纖維微電極(CFME).

1.3　石墨烯修飾的碳纖維微電極的制作

取適量的氧化石墨烯分散液于試管中，將已制作好的碳纖維微電極和Ag/AgCl參比電極放入氧化石墨烯中，在+1.2 V下電沉積適當(dāng)時(shí)間，即在碳纖維超微電極表面構(gòu)建了石墨烯修飾層，取出用超純水沖洗、晾干，即得修飾好的電極.

2　結(jié)果與討論

2.1　碳纖維微電極的毒化和活化

將一根潔凈的碳纖維微電極先在100μmol/L DA溶液中進(jìn)行差分脈沖掃描，再置于100 μmol/L 5-HT溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10次，掃描速度為100 mV/s，掃描范圍-0.1～0.7 V，結(jié)果見圖1.

圖1　碳纖維微電極的循環(huán)伏安圖(a)和差分脈沖圖(b)　　Fig.1　Cyclic voltammetry (a) and DPV curves (b) of carbon fiber microelectrode

如圖1所示，電流隨掃描次數(shù)增加而迅速減小，說明5-HT對(duì)電極表面有嚴(yán)重的毒化作用.將毒化后的電極在100μmol/L DA中差分脈沖掃描，毒化前后電極在DA溶液中差分脈沖圖見圖2.由圖2可見，毒化后的電極在多巴胺中氧化峰電流遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于毒化前，說明5-HT對(duì)電極表面有嚴(yán)重的毒化作用.

2.2　石墨烯電沉積電壓對(duì)再生電極電化學(xué)性能的影響

取適量的氧化石墨烯分散液于試管中，將已制作好的碳纖維微電極和銀電極放入氧化石墨烯分散液中，分別在0.6,1.2,1.8V的初始電壓下電沉積200 s，取出后在超純水中沖洗，晾干.再在100μmol/L DA溶液中進(jìn)行差分脈沖掃描，檢測(cè)并記錄其電化學(xué)響應(yīng)，結(jié)果見圖2.如圖2所示：在初始電壓1.2 V的條件下電極電鍍效果較好，初始電壓過小活化效果不明顯，初始電壓過高峰電流增幅不大，峰型變寬而且峰電位有所改變.故選擇1.2V為最佳電鍍初始電壓.

a) 0.6 V; b) 1.2 V; c) 1.8 V圖2　碳纖維微電極在不同初始電壓下的活化效果 Fig.2　Activation effect of carbon fiber microelectrode under different initial voltages

2.3　石墨烯電沉積時(shí)間對(duì)再生電極電化學(xué)性能的影響

取適量的氧化石墨烯分散液于試管中，將已制作好的碳纖維微電極和銀電極放入氧化石墨烯中，在1.2 V下電沉積一定時(shí)間，即在碳纖維超微電極表面構(gòu)建了石墨烯修飾層，取出用超純水沖洗、晾干，即得修飾好的電極.將修飾電極在100 μmol/L DA中進(jìn)行差分脈沖掃描，檢測(cè)再生電極的電化學(xué)性能，記錄伏安響應(yīng)信號(hào)，分析得出最佳的石墨烯電沉積時(shí)間，結(jié)果見圖3.

a)200 s ; b) 300 s; c) 500 s; d) 530 s圖3　碳纖維微電極在不同電沉積時(shí)間的電化學(xué)行為Fig.3　Electrochemical behavior of carbon fiber microelectrode at different electrodeposition time

如圖3所示：隨著電沉積時(shí)間的增加，活化電極的電化學(xué)響應(yīng)增加；但電沉積時(shí)間超過500 s后，活化電極的電化學(xué)響應(yīng)減小，500 s為最佳電沉積時(shí)間.

2.3　活化電極的穩(wěn)定性

活化后電極在20 mM Tris-HCl、0.10 mmol/L的多巴胺溶液中差分脈沖掃描，掃描1次后室溫放置1周再進(jìn)行第2次掃描，連續(xù)掃描5周，結(jié)果見圖4.如圖4所示，再生后的電極在DA溶液中差分脈沖峰電流變化不大，說明再生電極電化學(xué)性能較穩(wěn)定.

圖4　活化后的電極差分脈沖伏安疊加圖Fig.4 DPV overlay chart of activated electrode

2.4　修飾電極的電化學(xué)性能研究

比較電極修飾前，毒化后及活化后在100 μmol/L NE，1.0 mmol/L AA溶液中的差分脈沖曲線，結(jié)果見圖5.由圖5分析可知，再生電極對(duì)NE電化學(xué)響應(yīng)良好，對(duì)(抗壞血酸)AA幾乎無(wú)響應(yīng).由于氧化石墨烯表面結(jié)構(gòu)有環(huán)氧基，邊緣有羧基，在pH 7.2的Tris-HCl中，電離帶負(fù)電荷，NE在pH 7.4的Tris-HCl的環(huán)境中帶正電荷，而AA帶負(fù)電荷，由于異性電荷相吸引，故NE聚集在電極附近，氧化還原峰電流提高，同性電荷相斥，帶負(fù)電荷的AA被排斥，在修飾電極上靈敏度降低.

圖5　電極在100 μmol/L NE(a)和1.0 mmol/L AA(b)溶液中的差分脈曲線Fig.5　DPV curves of modified electrode in 100 μmol/L NE(a) and 1.0 mmol/L AA(b)

2.5　DA氧化峰電流與掃速的關(guān)系

圖6a為測(cè)定活化電極在1.0×10-4mol/L DA溶液中，在不同的掃速下(0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5,1.0 V/s)的循環(huán)伏安圖. 以掃描速度為橫坐標(biāo)，氧化峰電流為縱坐標(biāo)繪制工作曲線如圖6b所示，其氧化峰電流與濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為I(A)= 8.6405ν (V/s)+0.8038，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，說明氧化石墨烯修飾碳纖維電極上的DA的氧化過程受吸附控制.

圖6　氧化石墨烯活化電極的循環(huán)伏安圖(a)及峰電流與掃速的關(guān)系(b)Fig.6　Cyclic voltammograms at carbon fiber electrode modified with graphene oxide (a) and relation curve of peak currents and sweep rate (b)

2.6　工作曲線

考察在20 mmol/L Tris-HCl(pH 7.2)緩沖溶液中，用差分脈沖方法測(cè)出的氧化石墨烯修飾電極上DA溶液的氧化峰電流與濃度(0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100 μmol/L)關(guān)系，結(jié)果見圖7.由圖7a可知，隨著DA濃度的增加，活化后的電極氧化峰電流也隨之增大.以DA濃度為橫坐標(biāo)，氧化峰電流(平行測(cè)定3次取平均值)為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，如圖7b所示，其氧化峰電流與濃度線性關(guān)系良好，回歸方程為I(A)=0.0577c(μmol/L)+0.56，相關(guān)系數(shù)R2=0.9905.

圖7　氧化石墨烯修飾的電極在不同濃度DA溶液中的DPV曲線(a)及氧化峰電流與DA濃度的關(guān)系曲線(b)Fig.7　DPV at carbon fiber nanoelectrode modified with graphene oxide in the different concentrationm solution of DA (a) and relation curve of oxidation peak currents and concentration of DA(b)

2.7　加樣回收實(shí)驗(yàn)

在已準(zhǔn)確測(cè)定的初始濃度分別為100, 10, 1μmol/L的DA溶液10 mL并分別加入已知濃度10 mmol/L的DA溶液100,10,1 μL，并計(jì)算該混合溶液的真實(shí)濃度c真.用氧化石墨烯活化后的電極檢測(cè)其3種濃度DA溶液的峰電流，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線I(A)=0.0577c測(cè)(μmol/L)+0.56計(jì)算出檢測(cè)值的值，通過公式計(jì)算加樣回收率，R(%)=c測(cè)/c真×100%，結(jié)果如表1所示. 由表1可見，加樣回收率均在95%～105%，說明在此優(yōu)化條件下，利用DPV測(cè)定DA，結(jié)果可靠.

表1加樣回收數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表(n=3)
Tab.1Statistical table of recovery test data (n=3)

編號(hào)c0/(μmol?L-1)加樣體積V/μLc真/(μmol?L-1)c測(cè)/(μmol?L-1)加樣回收率R/%1100100198．0195．7±0．9198．83±4．572101019．9820．20±0．95101．1±4．783111．9991．98±0．0799．13±3．76

2.8　共存物質(zhì)的影響

考查了生物體內(nèi)常見的無(wú)機(jī)離子及有機(jī)物對(duì)活化電極測(cè)定100μmol/L DA測(cè)定的影響，結(jié)果表明：1.0 mmol/L K+，Na+，Cu2+，Ca2+，Cl-，AA及20 mg/L葡萄糖、核糖核酸、L-半胱氨酸對(duì)測(cè)定的影響較小，相對(duì)誤差均控制在±5%以內(nèi)，說明該方法具有良好的選擇性.

3　結(jié)論

(1)通過制備碳纖維微電極，在100μmol/L 5-HT溶液中采用循環(huán)伏安法毒化10圈后，使碳纖維電極表面形成一層絕緣膜，再通過電沉積法修飾石墨烯(0.5 mg/mL)對(duì)碳纖維電極進(jìn)行活化，得出了石墨烯最佳電沉積時(shí)間為500 s，最佳電鍍電壓為1.2 V，且活化電極的電化學(xué)響應(yīng)增加.

(2)活化電極在100μmol/L DA中氧化峰電流與掃速線性關(guān)系良好，回歸方程為I(A)= 8.6405ν (V/s)+0.8038，相關(guān)系數(shù)R2=0.9992，說明氧化石墨烯修飾碳纖維電極上的DA的氧化是受吸附控制.

(3)氧化石墨烯修飾電極在0.1～100 μmol/L DA溶液中，溶液的濃度與氧化峰電流線性關(guān)系良好，回歸方程為I(A)=0.0577c(μmol/L)+0.56，相關(guān)系數(shù)R2=0.9905.該再生電極在檢測(cè)DA溶液的抗干擾能力良好，有望用于活體中DA濃度的測(cè)定.

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