熱休克預(yù)處理大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的抑制作用

汪慶如，李欣然，王 清，謝嘉欣，付霞霏

0 引 言

隨著化療方案的不斷改進(jìn),腫瘤患者的生存率逐漸提高,年輕女性化療后的卵巢功能及生活質(zhì)量不容忽視。大量研究表明,化療藥物可誘發(fā)卵巢顆粒細(xì)胞(granulosa cells，GCs)或卵母細(xì)胞凋亡,以及異常激活休眠卵泡池;也可直接損害卵巢周圍血供,使卵巢組織纖維化，破壞卵巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備減少, 生育能力下降, 最終導(dǎo)致卵巢功能不全[1]。因此, 積極尋求有效治療化療所致卵巢功能不全的方案, 最終改善卵巢功能及生育能力, 已成為臨床亟待解決的難題。

近年來, 干細(xì)胞憑借多向分化潛能和自我復(fù)制能力被應(yīng)用于修復(fù)卵巢組織和恢復(fù)其功能的實(shí)驗(yàn)研究, 為恢復(fù)患者卵巢功能及生育能力帶來了希望。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可進(jìn)行自體移植而排除免疫排斥反應(yīng)[2]，通過促進(jìn)卵巢血管生成、改善卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況從而改善化療所致的卵巢功能不全，修復(fù)卵巢功能[3]，但無法使卵巢功能恢復(fù)到正常水平，因此進(jìn)一步尋求提高干細(xì)胞治療功效的手段十分必要。提高移植干細(xì)胞的存活率是提高療效的關(guān)鍵，前期研究已證實(shí)，熱休克預(yù)處理可降低干細(xì)胞的凋亡率，提高干細(xì)胞的治療效果[4]，但目前尚未有熱休克預(yù)處理MSCs治療化療性卵巢功能不全的實(shí)驗(yàn)研究。

因此，本研究擬通過熱休克預(yù)處理大鼠MSCs，研究熱休克對(duì)干細(xì)胞的影響。進(jìn)一步研究熱休克預(yù)處理后的干細(xì)胞對(duì)化療誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞的影響，明確熱休克預(yù)處理MSCs是否具有抑制化療誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有正常動(dòng)情周期的清潔級(jí)雌性Wistar大鼠，體重180～200g，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(粵)2016-0041]。動(dòng)物飼養(yǎng)條件：室溫(23±2)℃，濕度45%～55%，光照時(shí)間12 h，通風(fēng)良好, 標(biāo)準(zhǔn)飼料, 自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d。

1.2 骨髓MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定將大鼠以頸椎脫臼法處死后，用75%的乙醇浸泡5～10 min，在無菌條件下剝離脛骨和股骨，骨端剪除, 抽取DMEM完全培養(yǎng)基1 mL從一端將骨髓沖出, 制備單細(xì)胞懸液,制備成單細(xì)胞懸液，按1×106個(gè)細(xì)胞/mL將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中, 置于37 ℃, 5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天換1次液。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶約80%時(shí)進(jìn)行1∶2傳代，取第3代大鼠BMSCs, 制成單細(xì)胞懸液, 對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志 CD44、 CD45、 CD29、CD34用流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)行鑒定。選取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠骨髓MSCs進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠GCs的分離、培養(yǎng)、形態(tài)觀察及鑒定

1.3.1 大鼠GCs的分離及培養(yǎng)每只大鼠提前48 h注射皮下注射孕馬血清(100 IU/只)，于麻醉后打開腹腔，在無菌條件下取出雙側(cè)卵巢，用含有1% 雙抗的PBS漂洗，在含有1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)液中反復(fù)用針頭刺破卵泡,輕輕將GCs壓入培養(yǎng)液中制成細(xì)胞懸液。用200目細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液去除多余殘?jiān)?，離心半徑5.5 cm，1000 r/min離心10 min。棄上清液，細(xì)胞沉淀中加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中重懸，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后進(jìn)行觀察，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)做換液處理，每3天換液1次。

1.3.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的形態(tài)觀察取生長旺盛第5天的大鼠GCs，使用0.25%含EDTA的胰酶在37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 s, 棄去胰酶, 使用培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出爬片，PBS清洗3 min×3次;4%的多聚甲醛4 ℃固定20 min, PBS清洗5 min×3次。HE染色:蘇木精染色3 min, 鹽酸乙醇分化液分化15s，稍水洗, 氨水返藍(lán)15 s,流水沖洗;伊紅染色3 min,流水沖洗，脫水，透明，中性樹脂封片, 顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞FSHR的表達(dá)鑒定將胰酶消化后的細(xì)胞接種于細(xì)胞爬片上, 培養(yǎng)48 h后取出爬片, PBS洗滌3 min×3次;4%多聚甲醛固定15 min, PBS清洗3 min×3次; 0.5%Triton X-100細(xì)胞通透液, 在室溫條件下?lián)u床上孵育通透20 min, PBS充分淋洗;在培養(yǎng)皿中加入5%BSA，37 ℃封閉30 min, PBS清洗3 min×3次;每個(gè)培養(yǎng)皿中滴加稀釋好的一抗:FSHR(1∶500)，放入濕盒中，4 ℃孵育過夜。取出培養(yǎng)皿后室溫靜置45 min，PBS浸洗后，滴加聚合HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS充分淋洗。DAB顯色5～10 min，自來水沖洗1 min ；蘇木精復(fù)染3 min，鹽酸乙醇分化，返藍(lán)；自來水沖洗1 min，脫水、透明、封固、鏡檢。

1.4 熱休克預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞前期研究表明，熱休克預(yù)處理的最佳溫度為42 ℃[5]，因此本實(shí)驗(yàn)熱休克預(yù)處理的溫度設(shè)定為42 ℃。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)探索了熱休克預(yù)處理的最佳時(shí)間，結(jié)果表明42 ℃水浴1 h時(shí)MSCs的凋亡率最低，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用的熱休克預(yù)處理?xiàng)l件為42 ℃水浴1 h。

1.5 最佳熱休克預(yù)處理?xiàng)l件下MSCs生物學(xué)特性的改變實(shí)驗(yàn)共分為4組：空白對(duì)照組、熱休克對(duì)照組、模型組、熱休克模型組。根據(jù)前期查閱文獻(xiàn)，并進(jìn)行相關(guān)預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終選定順鉑作用劑量為5 mg/L[6]。空白對(duì)照組為不予其他處理的MSCs，熱休克對(duì)照組為熱休克預(yù)處理后的MSCs，模型組為順鉑(5 mg/L)作用后的MSCs，熱休克模型組為熱休克預(yù)處理后再予順鉑(5 mg/L)作用的MSCs。

1.5.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力在96孔板中按照2×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度進(jìn)行鋪板，每孔體積100 μL，每組5孔細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁生長后，每孔分別加入10 μL CCK8測(cè)試液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1～4 h后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè) 490 nm吸光度值A(chǔ)490。連續(xù)7 d重復(fù)此操作。

1.5.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs的凋亡率各組細(xì)胞分別處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集單細(xì)胞懸液，使用流式細(xì)胞儀采用Annexin-V/PI方法檢測(cè)MSCs凋亡率。

1.5.3 Hoechst33342/PI測(cè)定細(xì)胞存活率各組細(xì)胞分別處理后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集單細(xì)胞懸液至培養(yǎng)皿中，用固定液固定15 min后去除，并用 PBS浸洗3次，每次3 min；加入Hoechst33342染色液染色5 min后去除染色液，再用PBS洗3遍，每次3 min；加入PI染色液，置于4 ℃冰箱孵育30 min后去染色液，再用PBS洗3遍，每次3 min；吸盡液體，用抗淬滅封片液封固，于熒光顯微鏡下拍照。

1.6 熱休克預(yù)處理MSCs對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的GCs凋亡的影響實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、模型組、MSCs模型組、HS-MSCs模型組。對(duì)照組為未經(jīng)處理的GCs；模型組為經(jīng)順鉑(5 mg/L)作用后的GCs；MSC模型組、HS-MSCs模型組為GCs加入順鉑(5 mg/L)誘導(dǎo)凋亡后24 h分別與MSCs、HS-MSCs以1∶1比例加入Transwell培養(yǎng)板中實(shí)現(xiàn)GCs與MSCs的共培養(yǎng),培養(yǎng)板上層以每個(gè)小室2×105個(gè)細(xì)胞加入MSCs、HS-MSCs，培養(yǎng)板下層加入GCs。各組加入含10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后以流式細(xì)胞儀測(cè)定各組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率，以Hoechst33342/PI法測(cè)定卵巢顆粒細(xì)胞凋亡及存活率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單向方差(One-way ANOVA)分析法，使用多重比較SNK法比較組間差異。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)MSCs細(xì)胞至第3代細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)均一, 為成纖維細(xì)胞樣的長梭形，見圖1。經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果：90%以上細(xì)胞為CD34和CD45陰性，CD44和CD29陽性，鑒定為非造血干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞。

圖 1 鏡下觀察大鼠MSCs形態(tài)( ×100)

Figure 1 Morphological observation of MSCs ( ×100)

2.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的觀察及鑒定鏡下觀察原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞呈圓形或橢圓形, 大小不一。培養(yǎng)24 h后顆粒細(xì)胞貼壁，呈單層貼壁集落樣生長,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì)，見圖2。HE染色后，顯微鏡下觀察貼壁顆粒細(xì)胞呈多突行或梭形,細(xì)胞伸出偽足相互連接，細(xì)胞核增大呈圓形,細(xì)胞質(zhì)顆粒均勻豐富，呈淡紅色；FSHR為卵巢顆粒細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白, 定位于細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞中FSHR表達(dá)情況顯示，95%以上的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕色目的蛋白表達(dá)，藍(lán)紫色的為細(xì)胞核。見圖3。因此可鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為卵巢顆粒細(xì)胞, 且純度達(dá)到95%以上。

2.3 熱休克預(yù)處理對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

2.3.1 熱休克預(yù)處理增強(qiáng)MSCs的增殖能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在第3、4天熱休克對(duì)照組細(xì)胞增殖水平顯著高于其他3組，與模型組相比，熱休克模型組第3、4天細(xì)胞增殖水平顯著增加(P<0.01)，提示熱休克預(yù)處理促進(jìn)MSCs增殖。見圖3。

2.3.2 熱休克預(yù)處理降低MSCs的凋亡率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱休克對(duì)照組MSCs的凋亡率顯著低于其他3組，與模型組相比，熱休克模型組凋亡率顯著下降(P<0.05)，提示熱休克預(yù)處理抑制MSCs凋亡。見圖4。

2.3.3 熱休克預(yù)處理增加MSCs的存活率經(jīng)Hoechst33342/PI雙染后，正常細(xì)胞呈現(xiàn)低藍(lán)+低紅熒光，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)高藍(lán)+低紅熒光，壞死細(xì)胞呈現(xiàn)低藍(lán)+高紅熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱休克對(duì)照組中呈現(xiàn)低藍(lán)+低紅熒光表現(xiàn)的細(xì)胞比例較空白對(duì)照組多，熱休克模型組呈現(xiàn)低藍(lán)+低紅熒光表現(xiàn)的細(xì)胞比例較模型組多，表明熱休克對(duì)照組細(xì)胞存活率高于空白對(duì)照組，熱休克模型組細(xì)胞存活率高于模型組，提示熱休克預(yù)處理MSCs可提高細(xì)胞存活率。見圖5。

a:電鏡( ×100)； b:HE染色( ×400)；c:免疫組化染色( ×400)

圖 2 鏡下觀察大鼠卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)

Figure 2 Observation of GCsafter staining

與模型組相比，*P<0.05；與空白對(duì)照組、模型組、熱休克模型組比較，#P<0.05

圖 3 熱休克預(yù)處理后MSCs的增殖水平

Figure 3 The proliferation of MSCs after heat shock pretreatment

2.4 熱休克預(yù)處理后卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡與模型組凋亡率[(53.81±1.89)%)]相比，對(duì)照組、MSCs模型組、HS-MSCs模型組[(31.13±2.81)%、(42.76±0.99)%、(36.72±0.96)%]顯著下降(P<0.05)；與MSCs模型組相比，HS-MSCs模型組凋亡率顯著下降(P<0.05)。說明MSCs和HS-MSCs均能抑制順鉑誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的凋亡，但HS-MSCs抑制效果更加明顯。各組細(xì)胞經(jīng)Hoechst33342/PI 雙染后，HS-MSCs模型組及MSCs模型組呈現(xiàn)高藍(lán)+低紅熒光表現(xiàn)的細(xì)胞比例較模型組少，但MSCs模型組多于HS-MSCs模型組，說明MSCs和HS-MSCs均能一定程度抑制順鉑誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的凋亡，但HS-MSCs抑制效果更加明顯。見圖6。

與模型組相比，*P<0.05；與空白對(duì)照組、模型組、熱休克模型組比較，#P<0.05

圖 4 熱休克預(yù)處理后MSCs的凋亡率

Figure 4 The apoptosis rate of MSCs after heat shock pretreatment

圖 5 Hoechst 33342/PI染色后各組MSCs凋亡或壞死( ×40)

Figure 5 The apoptosis or necrosis of MSCs detected by Hoechst 33342/PI staining ( ×40)

圖 6 通過Hoechst 33342/PI染色檢測(cè)各組GCs凋亡或壞死( ×40)

Figure 6 The apoptosis or necrosis of GCs detected by Hoechst 33342/PI staining ( ×40)

3 討 論

近年來，各類腫瘤的發(fā)病率逐年上升，化療藥是治療此類疾病的重要藥物。順鉑是臨床上常用的化療藥物, 有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。研究表明，順鉑可通過損傷卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞, 進(jìn)而影響卵泡生長和發(fā)育, 引起卵泡破壞和卵巢纖維化, 導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備減少[7]，本實(shí)驗(yàn)中，我們采用在體外培養(yǎng)細(xì)胞中加入順鉑模擬化療誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，進(jìn)一步研究MSCs對(duì)化療微環(huán)境中卵巢顆粒細(xì)胞的影響。前期研究證實(shí)骨髓MSCs在體內(nèi)外能抑制化療藥物誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，部分修復(fù)化療所致卵巢損傷[3, 8]，但不能完全恢復(fù)卵巢功能。移植后MSCs的大量凋亡、存活率低是導(dǎo)致治療效果不佳的主要因素[9-10]，因此如何預(yù)處理MSCs、提高移植細(xì)胞的存活率是提高療效的關(guān)鍵所在。

目前研究較多的MSCs移植前處理方法包括熱休克預(yù)處理、缺氧預(yù)處理、及MSCs的遺傳表觀修飾等[9, 11]，其中熱休克預(yù)處理具有方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、安全、處理時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。熱休克預(yù)處理常用的方法是42℃水浴[12]，然而關(guān)于熱休克預(yù)處理的時(shí)間目前尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。因此本實(shí)驗(yàn)選用4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，研究不同的熱休克預(yù)處理時(shí)間對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的的影響。我們的研究結(jié)果顯示，42 ℃熱休克預(yù)處理1 h能顯著減少M(fèi)SCs的凋亡，因此為MSCs的最佳預(yù)處理?xiàng)l件。我們的研究結(jié)果表明，42 ℃熱休克預(yù)處理1h能顯著降低骨髓MSCs的凋亡率，提高了干細(xì)胞的增殖能力及存活率。

研究表明，熱休克預(yù)處理可以在細(xì)胞的增殖、分化、損傷和修復(fù)等生理過程中發(fā)揮作用，提高細(xì)胞對(duì)損傷因子的保護(hù)作用，在體外保護(hù)細(xì)胞免受各種環(huán)境損傷，提高移植細(xì)胞的存活率[10]。熱休克預(yù)處理可產(chǎn)生熱休克蛋白抑制P53的活性或者Bax的轉(zhuǎn)位,使凋亡蛋白釋放減少[13],也可增加移植細(xì)胞HSP70、HSP90的表達(dá),進(jìn)一步抑制Caspase表達(dá)及活化，從而抑制細(xì)胞凋亡[5, 14-15]。熱休克預(yù)處理可提高干細(xì)胞對(duì)缺血再灌注損傷的修復(fù)率，增加對(duì)心肌起保護(hù)作用的金屬硫蛋白的表達(dá),減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放,從而進(jìn)一步保護(hù)心肌細(xì)胞[16]。另外有研究表明，熱休克預(yù)處理還可以產(chǎn)生少量的DNA雙鏈斷裂,誘導(dǎo)各種因子的保護(hù)作用，進(jìn)一步減少細(xì)胞損傷[17-18]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們建立了順鉑誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞損傷的體外模型，探究熱休克預(yù)處理MSCs對(duì)化療誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)熱休克預(yù)處理后的MSCs能更顯著抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，增加其存活率，與研究結(jié)果一致。

綜上所述，熱休克預(yù)處理MSCs的最佳條件為42℃熱休克預(yù)處理1h，熱休克預(yù)處理能抑制大鼠骨髓MSCs的凋亡，提高干細(xì)胞的存活及增殖能力，經(jīng)熱休克預(yù)處理的MSCs能顯著抑制化療誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，提示熱休克預(yù)處理的MSCs對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的大鼠卵巢損傷具有一定修復(fù)作用, 但其中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步探究。