給氧負(fù)壓傷口治療改善傷口微環(huán)境對(duì)組織增殖活性及血管化的影響

董 珊，蔣琪霞，湯雨佳，王建東

0 引 言

傷口微環(huán)境主要指?jìng)诖矞囟?、酸堿度、濕度等營(yíng)造的傷口環(huán)境，與組織生長(zhǎng)和傷口愈合密切相關(guān)[1-2]。慢性傷口常因傷口床偏堿性、溫度低于理想愈合溫度及濕度失衡等微環(huán)境改變致組織氧合異常而長(zhǎng)期停滯于炎癥期，延遲愈合[3-4]。慢性感染性傷口表現(xiàn)為傷口床溫度和酸堿度升高[5]、傷口周?chē)l(fā)紅、24 h滲液量>10 mL、引流不暢等[6]。負(fù)壓傷口治療(negative pressure wound therapy，NPWT)能夠促進(jìn)滲液引流，改善傷口微環(huán)境[7]；但持續(xù)負(fù)壓吸引會(huì)營(yíng)造局部低氧環(huán)境，降低77%～87%局部組織氧合能力而影響愈合[8-9]。近年來(lái)提出給氧負(fù)壓傷口治療(negative pressure wound therapy combined with topical oxygen therapy，NPWT+TOT)的方法能夠改善創(chuàng)傷性慢性傷口微環(huán)境，促進(jìn)傷口愈合[10-11]。組織增殖活性和血管化是傷口愈合機(jī)制中2項(xiàng)具有代表性的指標(biāo)[12]。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，采用臨床指標(biāo)結(jié)合分子標(biāo)記物進(jìn)一步觀察NPWT+TOT對(duì)組織增殖活性及血管化的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象納入2019年1月至10月于門(mén)診傷口護(hù)理中心就診的慢性傷口患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有NPWT適應(yīng)證的各種慢性傷口，如全皮層傷口、24 h滲液量>10 mL、引流不暢等；②年齡≥18歲；③患者知情同意并自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有NPWT的臨床禁忌證，如惡性腫瘤性傷口、未經(jīng)治療的骨髓炎、傷口處伴神經(jīng)、血管外露、活動(dòng)性出血或凝血功能障礙等；②有影響傷口愈合的全身合并癥，如血糖控制不佳、營(yíng)養(yǎng)不良、多器官功能衰竭等；③有意識(shí)障礙或不能主動(dòng)配合治療。脫落標(biāo)準(zhǔn)：①研究過(guò)程中患者對(duì)NPWT不耐受，或?qū)Ψ罅霞百N膜過(guò)敏；②研究過(guò)程中患者或家屬主動(dòng)提出退出研究；③干預(yù)不足1周死亡或失訪者。根據(jù)傷口愈合率的兩樣本率比較估算公式計(jì)算共需納入64例患者，并隨機(jī)分為試驗(yàn)組(n=32)和對(duì)照組(n=32)。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019NZKY-010-01)，并在中國(guó)臨床試驗(yàn)中心注冊(cè)(ChiCTR1900022165)。所有符合納排標(biāo)準(zhǔn)的患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2干預(yù)方法

1.2.1 分組干預(yù)由傷口治療師按照“知情同意-物品準(zhǔn)備-傷口評(píng)估-清洗清創(chuàng)-皮膚保護(hù)-設(shè)備準(zhǔn)備-置管并封閉-調(diào)節(jié)參數(shù)-觀察效果-健康教育”十步法操作流程對(duì)試驗(yàn)組患者實(shí)施NPWT+TOT[7，11]。置管時(shí)給氧管緊貼傷口床，填充等滲鹽水紗布，再將等滲鹽水紗布包裹的多側(cè)孔負(fù)壓吸引管道頭端置于填充敷料上方，傷口外覆蓋曲縮棉，并用自黏性半透膜封閉超過(guò)傷口邊緣2～3 cm的區(qū)域。采用“高舉平臺(tái)法”包裹并封閉負(fù)壓引流管和給氧管[7]。設(shè)置TOT(流量3 mL/h、氧濃度≥95%(V/V)、環(huán)境濕度≥30%)和NPWT(-120 mmHg負(fù)壓吸引5 min，停止2 min)參數(shù)。對(duì)照組患者除不增加TOT外，其余干預(yù)措施均與試驗(yàn)組相同。所有患者均連續(xù)干預(yù)2周，每周更換敷料及管道3次。

1.2.2共性措施①傷口床準(zhǔn)備：更換敷料時(shí)評(píng)估傷口床狀態(tài)，清除傷口壞死組織，傷口周?chē)つw給予氧化鋅軟膏保護(hù)[13-14]。②隨訪：繼續(xù)標(biāo)準(zhǔn)濕性治療，每周3次門(mén)診或一次微信隨訪至傷口愈合或3個(gè)月止。③全身干預(yù)：專(zhuān)科醫(yī)師控制患者基礎(chǔ)疾病及全身狀況；專(zhuān)職護(hù)士評(píng)估患者營(yíng)養(yǎng)狀況、制訂個(gè)體化口入營(yíng)養(yǎng)食譜，并對(duì)患者及家屬進(jìn)行傷口相關(guān)知識(shí)的健康教育[15]。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 主要結(jié)局指標(biāo)傷口愈合率為主要結(jié)局指標(biāo)，若更換敷料時(shí)傷口閉合且與3%H2O2溶液無(wú)氧化反應(yīng)則判斷為傷口愈合[15]。隨訪至干預(yù)后3個(gè)月，統(tǒng)計(jì)傷口愈合率及愈合時(shí)間。傷口愈合率=傷口愈合人數(shù)/入組患者數(shù)×100%。

1.3.2次要結(jié)局指標(biāo)①傷口溫度、酸堿度：每次更換敷料時(shí)測(cè)量并記錄。傷口溫度按“五點(diǎn)測(cè)溫法”用紅外線測(cè)溫儀(江蘇魚(yú)躍)測(cè)量傷口中心和周?chē)?、6、9、12點(diǎn)的溫度，并取平均值進(jìn)行比較[16]；傷口酸堿度采用一次性pH試紙(上海阿拉丁)置于傷口基底層，充分蘸取滲液后，參照比色卡讀取pH值。②傷口細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果：干預(yù)第0和14天采用Levine技術(shù)獲取患者傷口分泌物細(xì)菌標(biāo)本并送檢[16]，計(jì)算傷口細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率。③傷口組織增殖活性和血管化程度：于干預(yù)第0和14天取傷口基底部組織，送至病理科進(jìn)行組織固定、包埋、切片、脫蠟、熱修復(fù)，滴加一抗Ki67(邁新生物)和CD34(邁新生物)，4 ℃孵育過(guò)夜后，滴加二抗HRP Rabbit/mouse A液(Dako)，室溫孵育25 min后，加DAB(Dako)鏡下觀察顯色，隨后蘇木精染色、返藍(lán)、脫水、封片。Ki67陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞核染成棕黃色或棕褐色，反映細(xì)胞增殖能力，高倍鏡下(×400)隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)視野，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比的平均數(shù)，即Ki67陽(yáng)性率=[∑(細(xì)胞核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)細(xì)胞數(shù))]/3×100%；CD34陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)均勻棕黃色顆粒，反映組織血管化程度，參照Weidner校正法計(jì)算傷口組織微血管密度(microvessel density，MVD)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用Mauchly球形檢驗(yàn)，若Mauchly球形檢驗(yàn)P<0.05，則采用Greenhouse-Geisser檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 納入患者基線共納入慢性傷口患者64例，基線具有可比性，見(jiàn)表1。其中59例患者完成干預(yù)和隨訪，總體脫落率7.81%。試驗(yàn)組完成30例，脫落率6.25%；對(duì)照組完成29例，脫落率9.38%。

2.2傷口愈合率及愈合時(shí)間主要結(jié)局指標(biāo)按照全數(shù)據(jù)分析集(full analysis set，F(xiàn)AS)和符合方案分析集(per-protocol set，PPS)分別分析，試驗(yàn)組和對(duì)照組愈合率分別為87.5%(28/32)、75.0%(24/32)和93.33%(28/30)、82.76%(24/29)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FAS：χ2=1.641，P=0.200；PPS：χ2=1.577，P=0.209)。其中，對(duì)照組24例患者平均傷口愈合時(shí)間(63.38±14.21)d，試驗(yàn)組28例患者 (54.18±17.99)d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.021，P=0.049)。

2.3慢性傷口溫度、酸堿度變化對(duì)照組29例患者干預(yù)第7、14天傷口溫度分別為(33.08±0.59)℃和(33.78±0.38)℃，試驗(yàn)組30例患者為(33.48±0.68)℃和(34.28±0.55)℃，固定干預(yù)時(shí)間因素時(shí)，兩組傷口溫度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.982，P=0.018)。對(duì)照組29例患者干預(yù)第7、14天傷口pH值分別為7.42±0.16、7.22±0.13；試驗(yàn)組30例患者分別為7.38±0.18、7.11±0.11。固定干預(yù)時(shí)間因素時(shí)，2組傷口pH值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.701，P=0.406)。

表1 入組接受傷口護(hù)理患者的基線資料比較

Table 1 Comparison of general data between the two groups

項(xiàng)目對(duì)照組(n=32)試驗(yàn)組(n=32)t/χ2值P值性別[n(%)]0.0630.802 男18(56.25)17(53.13) 女14(43.75)15(46.87)年齡(歲)55.53±21.3158.84±20.470.6340.528身高(cm)166.34±7.45168.84±7.971.2960.200體重(kg)63.26±12.5967.48±10.021.4850.142BMI(kg/m2)22.71±3.5023.63±2.771.1670.248傷口類(lèi)型[n(%)]0.4400.979 壓力性損傷9(28.13)9(28.13) 手術(shù)切口不愈12(37.50)14(43.75) 創(chuàng)傷性傷口8(25.00)6(18.75) 其他3(9.37)3(9.37)傷口持續(xù)時(shí)間(d)92.97±81.31102.78±113.490.3930.695傷口溫度(℃)32.02±0.5632.04±0.800.1410.889滲液pH值7.77±0.177.80±0.180.7290.469細(xì)菌培養(yǎng)[n(%)]0.2770.599 陰性12(37.50)10(31.25) 陽(yáng)性20(62.50)22(68.75)

2.4患者傷口細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率試驗(yàn)組和對(duì)照組干預(yù)后細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率分別為26.67%(8/30)和41.38%(12/29)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.424，P=0.233)。

2.5患者傷口組織增殖活性與血管化程度連續(xù)干預(yù)2周后，試驗(yàn)組和對(duì)照組Ki67陽(yáng)性率和MVD均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 入組患者干預(yù)前后傷口組織Ki67陽(yáng)性率與微血管化密度的比較

Table 2 Comparison of Ki67 positive rate and microvascularization density in wound tissue between the two groups before and after intervention

組別nKi67陽(yáng)性率0 d14 dMVD0 d14 d對(duì)照組2917.20±4.7525.51±7.469.83±3.7712.50±3.64試驗(yàn)組3017.28±7.3231.39±13.728.18±3.0815.37±4.82t值0.0482.3821.8392.572P值0.9620.0210.0710.013

圖 1 干預(yù)前及干預(yù)14 d Ki67、CD34的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)

Figure 1 Ki67, CD34 expression before and after intervention for chronic wounds in two groups (IHC ×400)

3 討 論

由于血供受損、組織氧合異常，慢性傷口溫度較身體核心溫度約低5 ℃[1]。同時(shí)傷口低溫亦引起血管收縮、血流減少而延緩傷口愈合，局部表現(xiàn)為組織蒼白、低溫[6]。當(dāng)NPWT采用間歇模式時(shí)，傷口周?chē)M織血供最豐富[7]，但負(fù)壓的吸引作用會(huì)降低局部組織氧分壓[8-9]。因此，通過(guò)外源性補(bǔ)充3 mL/h的純氧是提高傷口氧濃度的重要方式[17]。本研究通過(guò)分析不同干預(yù)措施下傷口溫度變化得出，NPWT+TOT與NPWT均能提高傷口床溫度，但NPWT+TOT效果更優(yōu)。可能與間歇模式下NPWT改善傷口周?chē)┖蚑OT提高組織氧分壓，改善局部氧合有關(guān)[10]。正常皮膚組織pH值為4～6，能夠避免細(xì)菌、真菌的感染，當(dāng)皮膚完整性破壞后，局部pH值會(huì)達(dá)到7.4，甚至高達(dá)8～9[1, 10]，此時(shí)傷口在感染的狀態(tài)下更易形成金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌等的細(xì)菌生物膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解而延緩愈合[10]。在本研究中，兩種干預(yù)措施均降低了傷口處pH值，且以試驗(yàn)組降低更為顯著。與干預(yù)前相比，試驗(yàn)組和對(duì)照組均降低了傷口處細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率。雖在干預(yù)14 d時(shí)，2組細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但試驗(yàn)組細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性率下降更明顯。分析原因主要包括以下方面：①NPWT能夠快速充分引流滲液，減輕傷口炎癥反應(yīng)，改善周?chē)?，并使局部組織發(fā)生宏觀和微觀形變，促進(jìn)壞死腐肉組織的清除和新鮮肉芽組織形成，從而增強(qiáng)局部抗菌能力[7]。②在“讓傷口有氧”理念的基礎(chǔ)上，給予3 mL/h的純氧能直接抑菌殺菌，抑制細(xì)菌生物膜形成[18-20]；同時(shí)在傷口處形成氧分壓梯度，促進(jìn)氧向周?chē)M織的擴(kuò)散[17]。③NPWT+TOT持續(xù)作用于傷口局部，協(xié)同改善周?chē)貉h(huán)而達(dá)到傷口理想愈合溫度、pH值，弱化細(xì)菌生長(zhǎng)與增殖能力，形成有利于傷口愈合的微環(huán)境[10]。

組織增殖活性和血管化程度是衡量傷口愈合程度的代表性指標(biāo)，直接反映傷口肉芽組織生長(zhǎng)和新血管萌發(fā)[12]。其中，Ki67是一種細(xì)胞核增殖抗原，反映細(xì)胞增殖活躍程度，是組織增殖活性常用的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)；CD34抗原在血管內(nèi)皮細(xì)胞呈穩(wěn)定陽(yáng)性，是血管內(nèi)皮細(xì)胞可靠的標(biāo)志物。本研究在NPWT的基礎(chǔ)上聯(lián)合TOT治療各類(lèi)慢性傷口。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，試驗(yàn)組與對(duì)照組的Ki67陽(yáng)性率和平均MVD均有提高，且試驗(yàn)組提高更明顯。推測(cè)NPWT+TOT改善傷口愈合的微環(huán)境，提高傷口溫度，降低pH值，抑制傷口處細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖，為組織增殖和血管新生提供條件[12]。同時(shí)通過(guò)負(fù)壓吸引作用可有效清除壞死組織、持續(xù)純氧輸注提高局部氧濃度也能明顯改善肉芽組織，促進(jìn)膠原纖維的積聚和新血管形成[21]。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，TOT能夠刺激難愈性慢性傷口愈合[22]、加快上皮化速度[23]，據(jù)此可以推斷，NPWT+TOT可以提高傷口組織增殖活性和血管化程度。

多項(xiàng)研究表明TOT能夠促進(jìn)慢性傷口愈合[17, 24-25]；尤其在嚴(yán)重慢性傷口中具有更好的效果[26]。本研究在NPWT的基礎(chǔ)上結(jié)合TOT治療慢性傷口中取得了較好的結(jié)果。本研究納入的64例患者中，81.25%的患者在隨訪期內(nèi)愈合，其中試驗(yàn)組愈合率較對(duì)照組高12.5%，雖然差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但通過(guò)改進(jìn)傷口護(hù)理措施、提高慢性傷口愈合率是傷口治療的最終目的，因此NPWT+TOT治療慢性傷口具有一定的臨床意義。試驗(yàn)組除脫落的2例患者外，未在隨訪期內(nèi)愈合的2例患者均為4期壓力性損傷，此類(lèi)患者傷口治療周期常為5～6個(gè)月或需要更久，再次證明了深度壓力性損傷的復(fù)雜性、長(zhǎng)期性和治療難度[15]。因此，未來(lái)需要增加樣本量進(jìn)一步研究NPWT+TOT治療深度壓力性損傷的適宜療程、隨訪周期等。對(duì)隨訪期內(nèi)的傷口愈合時(shí)間進(jìn)行分析，試驗(yàn)組平均傷口愈合時(shí)間較對(duì)照組短9.2 d，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.049)。初步表明，NPWT+TOT能夠縮短慢性傷口愈合時(shí)間。

綜上所述，NPWT+TOT能夠改善傷口微環(huán)境，提高傷口組織增殖活性和血管化程度，為促進(jìn)傷口愈合創(chuàng)造了有利的傷口床環(huán)境，是臨床慢性傷口的有效治療方案。未來(lái)仍需進(jìn)一步實(shí)施大樣本高質(zhì)量的隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)一步證實(shí)NPWT+TOT在慢性傷口中的對(duì)組織增殖活性和血管化的作用機(jī)制及其適宜療程等。